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实验七 人体性染色质小体的观察 2009年11月 一、实验目的 掌握人体性染色质的检测方法； 观察人体性染色质的形态特征及存在部位；为进一步研究人体染色体的畸变与疾病提供参考条件； 了解雌性哺乳动物X染色体失活假说和剂量补偿效应的机制。 二、实验原理 1949年M.L.Barr等研究发现雌猫神经细胞核膜内凝缩的深染小体[性染色质体(sex-chromatin body)或巴氏小体(Barr body)]，而雄性个体细胞中则没有。 进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。 为什么正常男女之间的X染色质存在差异？ 为什么女性两个X染色体上的每个基因座的两个等位基因所形成的产物，不比只有一个X染色体半合子男性的相应基因产物多？ 为什么某一X连锁的突变基因在纯合子女性的病情并不比半合子的男性严重？ 剂量补偿效应（dosage compensation effect） 莱昂假说(Lyon hypothesis) 1961年，Mary Lyon 提出了X染色体失活的假说。其实验依据是对小鼠X连锁的毛色基因的遗传学观察，发现雌性小鼠毛色杂合体不表现显性性状，也不是中间类型，而是显性隐性两种颜色嵌合组成斑点状（不是共显性）。而雄性小鼠却从不表现斑点状毛色，而是显性或隐性单一颜色的毛色。 内容： ①巴氏小体是一条失活的X染色体；哺乳动物雌性个体两条X染色体的其中一条在受精后失活； ②两条X染色体中哪一条失活是随机的；在同一哺乳动物的体细胞中，有些父源X染色体失活，有些为母源失活。 ③失活在胚胎早期发生(人类在胚胎发育16天时)，失活的X染色体在以后分裂中不会复活；当生殖细胞形成时，失活的染色体可恢复。 ④杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体。 证据：1）玳瑁猫毛皮上的黑色和黄色班块——XOXo 2）人类葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定GdA/GdB X染色体失活的机制 X染色体上都存在与失活有关的Xic（X染色体失活中心）位点，Xic位点的丢失会影响萊昂化，胚胎不能存活。X染色体失活分起始、维持、扩散3个阶段。X染色体失活只是部分失活，在失活染色体的Xic位点上发现有活性的基因（XIST）。 X-染色质的形态特征及所在部位： X-染色质的形态表现为一结构致密的浓染小体；轮廓清楚；大小1～1.5μm；常附着于核膜边缘或靠近内侧；形状为凸形、三角形、卵形、短棒及双球形等。 正常女性口腔黏膜细胞中出现率：30 ～50%。 三、实验用品 1、器材： 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、牙签、解剖针等。 2、试剂： 改良苯酚品红、60%醋酸、45%冰醋酸、95%乙醇 3、实验材料： 女生口腔黏膜细胞（男生为对照）；女生毛囊细胞（男生为对照） 四、实验操作 1、口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察 （1）取干净载玻片，用记号笔在将涂细胞的一面右上角做好标记； （2）嗽口（三次），尽可能除去口中杂物； （3）用牙签刮取颊部粘膜上皮细胞，弃第一次刮取物，在同一部位继续刮取； （4）将刮得的细胞涂在干净载玻片上，反复几次，使玻片上的材料尽可能多些（每人做2张，1张女生的，1张男生的）； （5）空气中干燥； （6）涂片区滴上100μl的60%冰醋酸固定5分钟； （7）吸去冰醋酸，滴20μl改良苯酚品红染色2分钟； （8）压片； （9）镜检。 拔取带毛囊头发一段,置于载玻片上→滴100μl 45%乙酸解离5分钟后，吸掉乙酸→解剖针剥取外层毛囊细胞，在载玻片上将组织细胞均匀摊平→晾干→滴上100μl 改良苯酚品红染色10分钟→吸去染液，滴100μl 95% 乙醇分色，1分钟后吸掉→压片→镜检 X-染色质的辨认： 低倍镜下检出典型的可数细胞的标准： ①核质是网状或细颗粒状分布； ②核膜清晰、核无缺损； ③染色适度； ④周围无杂菌。 在高倍镜或油镜下进一步观察。 注意：在女性间期细胞核内侧靠近核膜处有约1微米大小的反光极强的颗粒状亮点，即为巴氏小体。材料不同，观察结果可能有不同，且必须和核仁区别开来（核仁往往离核膜较远或接近核中央部位）。 刮口腔上皮细胞前要漱口； 涂片略干再加改良苯酚口红； 染色时间不要太长，否则核质着色深，X染色质体不易区分； 毛囊细胞要充分解离，压片前可先用解剖针敲片，使细胞解离。 六、作业 （实验结果） 分别观察男女各50个可数细胞，计算显示