生物技术概论 2.基因工程.ppt

2. 基因工程 2.1 基因工程概况 2.1.1基因工程的基本含义 按照人们的愿望（人为的），进行严密的设计（类似工程设计），通过体外DNA重组（非生命活动过程）和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短的时间内趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。 2.1.2 基因工程的主要理论依据 不同基因具有相同的遗传物质(DNA/RNA) 基因是可以从DNA上切割下来的 基因是可以转移的 多肽与基因之间存在对应关系 遗传密码是通用的(绝少数除外) 可以通过DNA复制把遗传信息传递给下一代 2.1.3 基因工程研究的基本技术路线 2.1.4 基因工程突出的优点 打破了常规育种难以突破的物种之间的界限 可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组和转移 2.2.1 DNA 2.2.1.1 DNA的组成和结构 碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)4种。脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键连接。多个脱氧核苷酸按此方法连接成多聚脱氧核苷酸，其一端为游离的5′-磷酸基(5′-P)称为5′端；另其一端为游离的3′ -羟基(3′-OH),称为3’端。 反应过程： ※ 反应系统加热至90~95℃, 底物双链DNA变性成为两条单链DNA； ※ 降温至37~60℃,使引物与模板DNA链互补序列杂交 ( 复性 )； ※ 升温至70~75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物按5′→3′方向延伸, 合成模板DNA链的互补链。 ※ 重复以上过程，一般经过25～30次循环片段。 克隆载体种类 按构建克隆载体的材料来源分: 质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体 ...... 按克隆载体的用途分: 一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体 ...... 按克隆载体的受体生物分: 原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体 ...... 真核生物克隆载体 酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆 载体 、人克隆载体...... 2.3.4 体内同源重组整合载体（系统） 特点： 大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入; 没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦; 基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析； 原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单,繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 种类： 酵母：基因结构相对比较简单，便于基因工程操作；培养简单，适于大规模发酵生产，成本低廉；外源基因表达产物能分泌到培养基中,便于产物的提取和加工；不含特异性的病毒，不产生毒素，是安全的受体细胞。 植物细胞：具全能性。 有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草和拟南芥等。 动物细胞：目前多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞以及干细胞。 有猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等。 2.5.2 重组DNA分子导入受体细胞 2.5.2.1 外源DNA转化方法 化合物诱导转化法 根癌农杆菌介导转化法 电穿孔转化法 微弹轰击(基因枪)转化法 激光微束穿孔转化法 超声波处理转化法 脂质体介导转化法 体内注射转化法 花粉管通道转化法 精子介导法 低能离子束介导转化法 方式： 重组病毒直接感染受体细胞 重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞 重组病毒感染互补型受体细胞系 适用：主要用于基因组文库或cDNA文库的构建和动植物的转基因。 2.6.1.4 采用DNA分子杂交法鉴定重组子 Southern 印迹杂交 斑点印迹杂交 菌落（或噬菌斑）原位杂交 2.6.2 根据外源基因转录产物mRNA鉴定重组子 根据RT-PCR 扩增片段鉴定重组子 采用RNA分子杂交法鉴定重组子 Northern印迹杂交法 斑点印迹杂交 菌落（或噬菌斑）原位杂交 2.6.3 根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多 肽鉴定重组子 蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子 单向凝胶电泳 双向凝胶电泳 毛细管