1-印迹技术-3学时要点.ppt

（一）印迹技术（blotting）的原理;（二）分子杂交的原理;分子杂交(hybridization)的概念;探针（probe）技术;二、印迹技术的类别和应用;特点：灵敏度高（1~5ng），特异性好，固相膜保存时间长，可进行连续分析；无需放射性标记。 操作步骤： 蛋白质样品的制备； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 蛋白质的电转移； 蛋白质与抗体的结合及显色。;小 结（一）;DNA的变性与复性 ;核酸杂交概念图;;Southern blotting;Northern印迹杂交（RNA）;点杂交和狭缝杂交（dot/slot blot）;1.载片的清洁与处理 防止核酸酶污染与细胞、组织脱片（多聚赖氨酸）。 2.组织与细胞固定（4％的多聚甲醛） 保持组织细胞的形态与RNA 在组织细胞内的位置。 3.杂交前预处理（去垢剂和/蛋白酶） 增加探针的穿透力，促进杂交体形成。 4. 杂交 ;核酸的固定;核酸分子的转移;一、SDS蛋白质样品的制备;;SDS;Western-blotting;核酸杂交常用支持介质的类型和性质;1. NC（nitrocellulose，硝酸纤维素）膜 与蛋白质通过疏水作用结合，无须预先活化，对蛋白质的活性影响小，非特异性本底低。 小分子蛋白质在洗涤时易丢失，韧性差。 孔径：0.45μm， 0.22μm 2.PVDF(Polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯)膜 孔径： 0.22μm 机械强度高，上样量大。