抗阿尔茨海默病重组蛋白疫苗的克隆、表达和免疫学鉴定.docVIP

　　抗阿尔茨海默病重组蛋白疫苗的克隆、表达和免疫学鉴定 作者：林洁，刘景晶，陈庆梅，施小明 ［摘要］目的:制备抗阿尔茨海默病的重组蛋白疫苗。 方法 :将β淀粉样蛋白42肽N端表位Aβ115基因，通过来源于破伤风毒素的辅助性T细胞表位多肽TTP基因片段，与大肠杆菌L门冬酰胺酶Ⅱ（AnsB）基因的C末端融合，构建表达质粒pET28aAnsBTTPAβ115。转化至E. coli BL21，TBYE培养基（Kanr）培养，乳糖诱导表达，通过渗透休克、DEAE52cellulose和Sephadex G－100柱层析制备融合蛋白rAnsBTTPAβ115，通过酶活力和抗原性测定鉴定融合蛋白。结果:获得的融合蛋白rAnsBTTPAβ115保留了AnsB 71%的催化活力，具有与抗Aβ142抗体特异性结合的能力。结论:获得了在AnsB多聚酶分子表面呈现有Aβ115表位的融合蛋白rAnsBTTPAβ115,为抗阿尔茨海默病疫苗 研究 奠定了基础。 　　［关键词］阿尔茨海默病；重组疫苗；表位；表面呈现；抗原性 　　阿尔茨海默病（AlzhEimer’s disease，AD）是一种神经退行性疾病［1］，缺乏行之有效的 治疗 方法［2］。神经病理研究表明,β淀粉样蛋白42肽（Aβ142）的形成和聚集以及以其为核心形成的老年斑是AD发病的关键［2］。用人Aβ142肽免疫转基因小鼠模型引发的针对Aβ的自身免疫反应能有效减轻脑内Aβ的沉积，阻止老年斑的形成，明显改善记忆、认知和行为能力［3］。其临床研究也显示出良好的疗效，但有受试者出现中枢神经炎症状。Leverone等［4］证明N端15肽（Aβ115, DAEFRHDSGYEVHHQ）是Aβ142的B细胞表位，以其作为免疫原能够避免全肽免疫导致的不良反应，但是其免疫原性很弱，不利于诱导老年患者产生保护性免疫反应。提高B细胞表位的免疫原性是AD疫苗设计的关键［5］。大肠杆菌L门冬酰胺酶Ⅱ（LasparaginaseⅡ，Ans B）是由4个相同亚基组成的蛋白酶。我们曾用来源于破伤风毒素的辅助性T细胞表位多肽（tetanus toxin peptide, TTP; QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI）作为空间连接肽将人胆固醇脂转移蛋白C端的表位CETPC融合表达在AnsB的C端下游，发现AnsB能够作为表位多肽的呈现载体［6］。本研究试图获得表面呈现有Aβ115的重组嵌合酶融合蛋白AnsBTTPAβ115，利用AnsB的多聚化倾向［7］和TTP的免疫辅助功能来提高Aβ115的免疫原性，以期免疫后能够产生较强的体液免疫，进而达到安全有效防治AD的目的。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料质粒载体pET28aAnsBTTPCETPC为本室构建保存，pET28a购自TaKaRa公司；大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存；PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自华舜生物工程公司；DEAE52cellulose购自an；Sephadex G100 为Pharmacia产品；兔抗Aβ115多克隆抗体为Serotec产品；HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自博士德公司；各种限制性内切酶和连接酶均购自TaKaRa公司；AnsB纯品为本室制备保存；其他试剂均为进口分装或国产 分析 纯。 　　1.2 表达载体的构建引物序列见表1。以质粒pET28aAnsBTTPCETPC为PCR模板，使用上游引物p1和下游引物pAβ11521进行第1次加端PCR反应。循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min。取5μl进行琼脂糖电泳检测，然后用胶回收试剂盒回收，纯化获得相应长度的PCR扩增片段；取1μl作为第2次PCR加端扩增的模板，用上游引物p1和下游引物pAβ11522进行PCR反应，反应条件同上，试剂盒纯化产物，经NcoⅠ/HindⅢ双酶切，T4 DNA连接酶连接于经NcoⅠ/HindⅢ双酶切的pET28a表达载体，转化宿主菌BL21(DE3)，由于融合蛋白保留了AnsB全基因，可以通过检测酶活力筛选重组子，测序鉴定阳性重组子。 　　表1 构建表达载体pET28aAnsBTTPAβ115使用的引物（略） 　　Tab 1 Primer design of constructs of pET28aAnsBTTPAβ115 plasmids 　　1.3 工程菌的诱导表达阳性克隆接种于含卡那霉素50μg#12539;ml-1的LB固体培养基上，37℃培养16 h，挑取单菌落接种于TBYE培养基(含1% tryptone, 0.5% yeast extract和0.5% NaCl, 卡那霉素50μg#12539;ml-1，使用前加入葡萄糖