变性梯度凝胶电泳分离DNA片段及在土壤微生物组成分析中的.PDFVIP

博士学位论文公示材料 学生姓名 张颖 学号 0710228 二级学科 分析化学 导师姓名 孙挺 论文题目 变性梯度凝胶电泳分离 DNA 片段及在土壤微生物组成分析中的应用 论文关键词 变性梯度凝胶电泳；微生物组成；16S rRNA 基因；氮循环功能基因 论文摘要(中文) 由于生命科学发展的需要，DNA 成为分析化学的研究热点，其中 DNA 测序是现代分析化学的一项重要任 务。复杂样品 DNA 测序的前提是 DNA 的有效分离。变性梯度凝胶电泳（DGGE）是根据 DNA 碱基组成对 其进行分离的方法，该方法具有高通量、省时且成本较低等优点，是目前普遍应用的一种 DNA 检测技 术。 土壤微生物担负着重要的生命系统功能，主要参与有机质分解、养分循环和元素转化等生物学过程， 因而在维持和改善土壤质量方面发挥重要作用，这对于缓解粮食、能源、资源和环境等危机具有全球 性的重大意义。土壤微生物组成作为土壤系统的基本特征之一，其分析对分析技术提出了极高要求。 DGGE 技术通过分离 PCR 扩增的 DNA 片段检测 DNA，结合后续的 DNA 测序可分析样品中 DNA 组成，从而 通过 DNA 分析鉴定土壤微生物组成。由于土壤微生物由极其复杂的种群构成，因此，DGGE 对 DNA 片段 的高分辨率是 DNA 测序的关键。本研究的目的是确立 DGGE 有效分离土壤微生物 16S rRNA 和氮循环功 能基因片段的方法，将其与 DNA 测序结合分析土壤微生物组成。主要内容如下： 第一章主要介绍了广泛应用的三种微生物组成的检测方法、细菌和氮循环微生物的组成和分布、科尔 沁沙地概况以及相关植物群落。重点介绍了变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术的原理、应用、优点和局 限。给出了本研究的目的、内容和意义。 第二章主要以土壤结皮为实验材料，建立 DGGE 分离 16S rRNA 基因片段的方法。采用土壤基因组提取 试剂盒从植被为不同年龄的小叶锦鸡儿和 28 年的山竹岩黄蓍、差巴嘎蒿和小黄柳的土壤结皮中提取微 生物总 DNA，然后以微生物总 DNA 为模板，利用细菌和蓝藻 16S rRNA 特异性引物扩增细菌和蓝藻 16S rRNA 基因片段。在变性梯度为 30%-60%、电压和电泳时间为 80 V 和 9 h 的条件，细菌 16S rRNA 基因的 PCR 产物经 DGGE 分离出 14 个 DNA 片段，即 14 个条带。这些条带具有较好的重现性，条带清晰，条带与条 带之间的距离适于后续的条带切除，因此对所有条带成功进行了 DNA 测序。DGGE 分离蓝藻 16S rRNA 基 因片段的最佳变性梯度与细菌 16S rRNA 基因片段相同，而电压和电泳时间为 60 V 和 10 h。从蓝藻 DGGE 图谱上切除和成功测序的 DNA 片段较少，仅为 6 个。因此，DGGE 分离 16S rRNA 基因的最佳变性梯度为 30%-60%，而电泳条件因基因片段的来源和长度不同而不同。采用构建系统进化树的方法对 DNA 片段进 行了鉴定。结果显示，7 个细菌 16S rRNA 基因片段与 Escherichia 相关，另外属于 Bacillus、 Paenibacillus、 Shigella 和 Pseudomonas 的 DNA 片段也被发现。6 个蓝藻 16S rRNA 基因片段属于 Microcoleus、Leptolyngbya