新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7.docVIP

　　新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7 作者：关海容，孙玉英，袁志宏，张惠丽，梁飞，刘楠，郭斯启，习彩霞，奚永志 【摘要】 为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线，比较了不同组合的纯化策略和条件，包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等，并采用MTT法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性。结果表明，在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈，结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性，从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀。在蓝染料亲和层析一步分离中，由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多，极难区分目的蛋白和杂蛋白。但是，PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10，可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸，这十分有利于通过Ni-NTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物。根据这一特性，经反复筛选实验设计最终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线，用于纯化分离 B7-2-PE40KDEL融合蛋白。所得的目的蛋白的纯度可达95%以上，总回收率为8%。TT生物活性测定表明，该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用，而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用。结论：建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线，所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞。 【关键词】 重组外毒素融合蛋白 　　Establishment of Purification Procedure for Rebinant Fusion ProtEin B7-2-PE40KDEL 　　Abstract This study ed to establish do purification procedure by ethods and conditions atography，metal chelating chromatography，anion exchange chromatography，blue dye affinity chromatography，filtration chromatography and so on. The results shoatography，isolated protein of interest mediately after chromatography because methanol or acetonitrile atography expecting to purify the protein of interest in one step，protein of interest mixed protein as much proteins bound to the chromatography media by non-specific affinity. TT method shophocytes. 　　Key a 公司），胰蛋白胨、酵母提取物（Oxoid公司），MTT、NBT/BCIP试剂盒及碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体（华美生物工程公司），硝酸纤维素膜（Amershan Pharmacia），Tris（Augis），透析袋（Pierce公司），0.22 μm滤膜、滤器（Pall公司），超滤器（Millipore公司）。2YT培养基按照《分子克隆实验指南》配制。树脂分别为Ni-NTA binding resin（Novagen公司），Mono Q HR（5/5）及Superdex 75（Amersham Pharmacia）。 　　工程菌的培养及诱导表达 　　将工程菌种pRSETa-B7-2-PE40KDEL/BL21 pLysE接种于2YT培养基中，30℃培养12小时，按2%浓度接种于2YT培养基Amp+中，22℃培养5.5小时，然后加入0.1 mmol/L IPTG诱导培养12小时。 　　包涵体上清的分离 　　将大量诱导表达的菌液于4℃ 4500 rpm离心20分钟，收集菌体。以1/20体积的缓冲液重悬冻于-20℃，1小时后室温水浴融化，再冻融2次，超声破碎仪冰浴破碎（德国Braun公司）（大探头，功率100，时间20秒，频率0.5赫兹，重复3次），4℃ 12000 rpm离心15分钟，将获得的上清以0.2 μm滤膜过滤备用。 　　金属螯合层析 　　以3倍体积的缓冲液〖50 mmol/L Na2HPO4 (pH 7.2)、0.3 mol/L NaCl］平衡金属螯合层析柱，然后将滤好的包涵体上清上样于His-binding柱，流速为1 ml/min，再以