第十章电泳技术题库.pptVIP

第 十 章 电 泳 技 术;电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。 电泳分离则是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。;电泳为生化物质的分离提供了一个有效的和多功能的方法。 传统上，各类电泳仅用于常规的生化分析，直至上世纪70年代以后，各种以分离回收为目的的电泳法发展很快，已达到一定的分离制备规模。 ;与超滤等膜分离法一样，电泳分离中不存在相平衡，是一种速度分离法。 但与膜过滤相比，电泳操作的剪切作用较小，可以使蛋白质等生物大分子保持较高的生物活性。 分辨率高和能够保持产物的生物活性这两个突出的优点使得电泳技术愈来愈受到人们的重视。 ;10.1 电泳的理论基础;在自由溶液中，摩擦阻力服从Stokes定律： （10-2） 式中r为质点半径；v为质点的迁移速度；η为介质黏度。 ;合并上述两式，可求得质点的迁移速度v （10-3） ;如果电量Q按照电子电量e（=1.6×10-19C）乘上电荷数Z来计算，则上式可写成： （10-4） ;质点的电泳迁移率（电泳度）u被定义为在单位电位梯度（E）的作用下，单位时间内质点所移动的距离（d）： 或 （10-5） ; 所以可以得到 （10-6） 从上述公式可知，电泳迁移率与带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比。 ;对于两种离子型物质A和B的混合物的分离来说。如果它们的迁移率由实验测得是uA和uB，根据迁移率的定义可知： 和 dA和dB分别为各物质在电位梯度E下经过t时间后所移动的距离。 ;由上式可得到： （10-7） （10-8） 上式表明，用实验最终所得的（dA-dB），来确定A和B两种物质的分离，电泳需要持续的时间t。 ;10.2 影响电泳迁移率的因素;2．电场强度 电场强度越高，带电颗粒的迁移速度越快。 常压电泳控制的电场强度为2-10V/cm。;3．溶液的性质 主要是指电极室缓冲溶液和目标产物样品溶液的pH值、离子强度和黏度等。;① 溶液的pH值 溶液的pH值决定着电解质的解离程度和其所带净电荷的量，对于氨基酸或蛋白质，溶液的pH值应远离其等电点，使其净电荷量变大，迁移速度加快。 ;② 离子强度 组分的分离取决于缓冲液的离子强度，如果离子强度高，可获得良好的分离效果，但是电泳迁移率会降低，所以溶液的离子强度一般维持在0.05～0.1mo1/L范围内。;③溶液的黏度 电泳迁移率与溶液的黏度成反比，所以黏度不能过大或过小。;4．其它因素;;(2) 电渗 电渗现象是一种在外加电压作用下，和固体支持物接触的液体的移动现象。;如果支持物质带有羧基、磺酸基、羟基等功能团时，在一定的pH值溶液中，它们会电离，使支持物带负电荷，与支持物相接触的溶液(通常是水)带正电荷，在电场的作用下，此溶液层会向负极移动。 反之，若支持物带上正电荷，与支持物相接触的溶液就带上负电荷，溶液层会向正极移动。;电渗会对样品的迁移率造成影响。如果电渗方向与样品的电泳迁移方向一致，样品的表观迁移率就加快，如果二者的方向不一致，样品的表观迁移率就降低。;(3) 吸附 支持物吸附溶质，会延缓电泳分离。 在某些情况下，如果它们能选择性的吸附低电泳迁移率的组分，则可以提高分离的质量。;(4) 分子筛分离 ;(5) 扩散 扩散会影响分离的分辨率，这是因为扩散可使几个分离的区带相互重叠。;(6) 缓冲液的性质 分离效果有时取决于所用缓冲液的性质。 例如，对于不带电荷的蔗糖可用硼酸缓冲液分离，形成络合的蔗糖—硼酸盐离子。 ;10.3 电泳的类型;根据在电泳室中使用的电解质系统，可以对电泳作如下的分类： ①自由界面电泳； ②自由溶液中的区带电泳； ③在不同支持物上的区带电泳； ④在有机溶剂中的凝胶电泳； ⑤亲和电泳； ⑥等速电泳； ⑦等电聚焦； ⑧免疫电泳。 ;一．自由界面电泳;在自由界面电泳中，样品被放置在U型电泳管的缓冲溶液中，然后外加