毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞IRAK4表达的影响.docVIP

　　毒热平注射液对病毒感染巨噬细胞IRAK4表达的影响 作者：张艳丽，李秀萍，王宁萍，李澎涛 【摘要】 目的研究毒热平注射液对流感病毒感染的小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1 表达IRAK4(IL-1 receptor associated kinase 4, IRAK4)的影响。方法用100 TCID50流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)感染小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1后换用10 μg/ml浓度含药维持液继续培养，于12 h弃细胞上清液并收集细胞，提取细胞RNA和核蛋白，进行实时定量PCR反应（RT-PCR）和yD88的信号传导通路中IRAK4的表达有关。 【关键词】 毒热平； 流感病毒； 巨噬细胞；IRAK4 　固有免疫是机体抵御病原生物侵袭的首道防线，有研究表明，机体针对病毒及其他病原生物等病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns ， PAMP) 的入侵所产生的固有免疫及适应性免疫由模式识别受体(pattern recognition receptors ，PRR) 启动［1］。其中，TLR7可识别病毒单链RNA，以MyD88依赖的信号通路活化免疫细胞，在介导抗病毒免疫应答中发挥重要的作用［2］。本实验观察毒热平注射液对流感病毒感染后该信号通路中IRAK4信号蛋白的影响。 　 　1 材料 　　1.1 细胞狗肾细胞株（MDCK）购自军科院细胞室，由本室传代后使用；小鼠腹腔巨噬细胞株Ana-1购自南京凯基生物科技 发展 有限公司，由本室传代后使用。 　　1.2 病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株A/FM/1/47(H1N1)， 中国 中医药研究院中医所提供，本实验室-76℃保存备用。于九日龄鸡胚尿囊腔连续传代2次后，测血凝滴度为1∶512。 　　1.3 药物毒热平注射液（DRP），由黄芩、栀子、灯盏花和猪胆粉4味药物制成的中药复方注射剂，棕色液体，含生药17.4 mg/mL，由广东省康美药业有限公司开发提供。 　　1.4 试剂Dulbeccos Modified Eagle medium培养基（DMEM培养基）和RPMI-1640培养基，为GBICO公司产品；新生牛血清：民海生物公司产品。生长液：含10 %新生牛血清的1640培养液；维持液：不含血清而含2 μg/ml胰蛋白酶的1640培养液；引物及相关试剂由赛百盛生物公司合成提供；RT逆转录试剂盒购自Fermentas公司；SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自美国应用生物公司。一抗：P65 (sc-372)，Santa cruz 产品；二抗（抗兔）（ZB-2301）购自北京中山生物技术有限公司。 　 　2 方法 　　2.1 小鼠巨噬细胞株Ana-1的培养复苏小鼠腹腔巨噬细胞Ana-1，将细胞混悬于生长液中，37 ℃ 5 % CO2 培养箱培养，次日换液，3 d 后传代1次，取生长状态良好的Ana-1细胞，消化液作用5 min 后，弃去消化液，加入适量生长液，吹打细胞，计数并调细胞浓度为3×106/ml，移入12孔板, 每孔加细胞悬液1 ml，贴壁培养4 h后弃去未贴壁的细胞。 　　2.2 药物细胞毒性实验（MTT比色法）待Ana-1细胞生长状态最好时，用0.02%EDTA和0.5 %胰酶消化细胞，用生长液调整细胞至所需浓度，将该细胞液加入96孔细胞培养板中，100 μl/孔，于37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养至致密细胞单层。用维持液将毒热平注射液稀释为不同浓度，加入细胞培养板中，100 μl/孔，每个药物稀释浓度平行做3个复孔，同时设正常细胞对照。于37 ℃、5 % CO2 培养箱中培养72 h后，用MTT（终浓度为0.5 mg/ml）比色法检测药物对Ana-1细胞的毒性，按Reed-Muench法 计算 药物最大无毒浓度（TC0）和半数中毒浓度（TC50）。 　　2.3 病毒感染性测定（TCID50的测定）用无血清DMEM培养液对流感病毒FM1株行连续10倍递次稀释，将各稀释度的病毒接种于3×105 / ml的MDCK细胞中，每个稀释度平行做6个复孔，同时设正常细胞对照。37 ℃吸附2 h后吸弃病毒液换用维持液继续培养，每日在倒置显微镜下观察细胞病变效应，并记录病变程度和孔数，以细胞对照无明显退变，病毒感染细胞病变率达50 % 及以上的细胞孔为病变孔，细胞病变率小于50 % 的为非病变孔，按Reed-Muench法计算病毒的TCID50（median tissue culture infective dosage）。流感病毒FM1的TCID50=10-4.3 。 　　2.4 毒热平注射液作用于病毒感染的巨噬细胞用维持液稀释100 TCID50的流感病毒FM1株