氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增殖的影响.docVIP

　　氯离子通道阻滞剂对人眼小梁细胞增殖的影响 作者：丁会 王建国 李丹 刘伟 李志超 【摘要】 目的 探讨氯离子通道阻滞剂5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid,NPPB〕对体外培养人眼小梁细胞增殖的影响。方法 RTPCR检测体外培养人眼小梁细胞ClC3 mRNA表达，用不同浓度的NPPB作用体外培养的人眼小梁细胞，台盼蓝染色细胞计数法检测细胞存活率，四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测其增殖能力。结果 体外培养人眼小梁细胞存在ClC3 mRNA表达；不同浓度NPPB作用后小梁细胞存活率无显著差异；在一定浓度范围内（50～100 μmol/L），NPPB均可使体外培养的人眼小梁细胞增殖能力下降，其中100 μmol/L NPPB的作用最强。结结论 一定浓度的NPPB可降低体外培养的人眼小梁细胞增殖能力。 【关键词】 5硝基2(3苯丙胺)苯甲酸（NPPB）；小梁细胞；青光眼；RTPCR；MTT法 【Abstract】Objective To research the effect of chloride channel inhibitor 〔5nitro2(3phenylpropylamino)benzoic acid,NPPB〕on cultured human trabecular meshRNA expression of ClC3 in cultured human trabecular meshan trabecular meshetry，and to measure the cell proliferation RNA expressed in cultured human trabecular mesh 50～100 μmol/L，the cell survival rate had no significant difference，but the cell proliferation decreased.100 μmol/L NPPB had the most effect.Conclusions The cell proliferation of trabecular mesheshino)benzoic acid，NPPB〕作用于体外培养的人眼小梁细胞，观察其对细胞增殖的影响，以探讨氯离子通道在小梁细胞增殖中的作用。 　 　1 材料与方法 　　1.1 人眼小梁细胞的体外培养 　　永生株人眼小梁细胞（中山大学眼科中心卓业鸿教授馈赠），采用15%胎牛血清DMEM F12培养液，37℃培养箱中培养，每2～3天换液1次，细胞长满后，加入0.25%胰酶消化传代，传至第3～4代细胞均匀一致，融合后数量恒定，进行实验。 　　1.2 RTPCR检测人眼小梁细胞上ClC3 mRNA表达 　　取体外培养的永生株人眼小梁细胞，提取总RNA（步骤参照试剂盒），以RNA为模板，以逆转录方式获得cDNA，反应产物行PCR扩增。上游引物：5′GGGGTTTCTGTAGCTTTTGGTG3′；下游引物：5′CCACTGTCATATTGTCCTGTGTCAG3′，扩增条件：94℃预变性5 min，再进行30个循环，每个循环包括：94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸10 min，冷却到4℃。最后琼脂糖凝胶电泳观察。 　　1.3 MTT法检测小梁细胞增殖率 　　实验分为对照组和不同浓度NPPB组，取对数生长期永生株人眼小梁细胞细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化，用含15%胎牛血清的DMEM 培养液配成单个细胞悬液，以2.5×108 ml-1的密度接种于96 孔培养板中，每孔100 μl，37℃，5%CO2培养箱中培养。次日分别加入不同浓度NPPB（10、50、100 μmol/L），待加入后48 h检测，检测前4 h 每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃去培养液，用无血清培养液漂吸1次，加入MTT 裂解液（20% SDS，50%DMSO）100 μl，孵育箱孵育8 h后，微量振荡器振荡5 min，待紫色结晶完全溶解后，用酶标测试仪测定A 值，测定波长为570 nm， 参考 波长为630 nm。增殖率=处理组A值/对照组A值×100%。取3孔的平均值，每组重复3 次。 　　1.4 台盼蓝染色细胞计数检测小梁细胞存活率 　　实验分为对照组（DMSO）和不同浓度NPPB实验组（10、50、100 μmol/L），NPPB作用48 h后用0.08％台盼蓝进行染色，细胞计数监测细胞存活力。细胞存活率=(细胞总数-着染细胞数)/细胞总数×100%。每组重复3次，取平均值。 　　1.