2.微生物检测要点.ppt

微生物检测技术;微生物的定义和分布;微生物的分类;细 菌 形 态 特 征;细菌细胞形态显微镜检照片;微生物的五大共性;细菌结构;G+和G-;;无菌/微生物限度检查理念;微生物实验室保障系统;实验室的建设（硬件）;试验环境的要求及无菌操作;培 养 基 的 基 础 知 识;培 养 基 的 基 础 知 识;培 养 基 的 基 础 知 识;培养基;培养基种类（无菌检查用）;培养基适用性检查; 微生物的生长（population growth）与代时（generation time） 不同微生物的代时范围是20min~10h 大肠埃希菌：20min 枯草芽孢杆菌：28min 金黄色葡萄球菌：30min 铜绿假单胞菌：35min 大肠埃希菌20min繁殖一代，繁殖13h后，其子代细胞数可以达到1 × 1013个（约等于人体全部细胞数），培养24h后子代细胞数则可以达到4.7 × 1021个;灵敏度检查;灵敏度检查;灵敏度检查;无菌检验有两种方法：直接接种法、薄膜过滤法 直接接种法:将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。 薄膜过滤法:含抗菌、抑菌成分的供试品会抑制某些微生物的生长繁殖,所以用常规方法检查会出现假阴性的结果, 但并不等于产品中没有微生物甚至是致病性微生物。所以采用薄膜过滤法来去除供试品中可溶的抑菌性成分,把细菌等微生物截留在滤膜上,然后再经过处理培养使所含微生物生长繁殖, 从而使微生物检出。; 当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。 ??????验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。; 菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球菌?、?枯草芽孢杆菌??、?生孢梭菌、?白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。 方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。; 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培养3天~ 5天。各试验菌同法操作。;; 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。 ??? 方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。 ;无菌操作（sop）;无 菌 技 术;无 菌 技 术;无 菌 技 术;无 菌 技 术;无菌检查法 试验前准备; 供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。进入无菌检验室的样品若有两层（或两层以上）包装的，需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。 操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。; ;阴性对照（目的是验证试验是否存在污染） ：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作???作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 阳性对照（目的是验证试验可靠性，防止假阴性）：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养(48 ~ 72)小时应生长良好。;无菌检查法 –直接接种法;无菌检查法 –直接接种法; ;无菌检查法 培养及观察; 若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。 ; ; 试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符