短暂性MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用.docVIP

　　短暂性MCAO大鼠注射天麻素具有神经保护作用 作者：杨杰，赵朝华，宗长宏，张峰昌，陈国敏 【摘要】 目的： 探讨天麻素对缺血性脑损伤的神经保护作用. 方法 ： 通过线栓技术闭塞大脑中动脉（MCAO）2 h诱导建立暂时性局部脑缺血模型，SD大鼠腹腔内连续注射天麻素3 d. 采用TUNEL染色测定缺血边缘区细胞凋亡；免疫组织化学染色观测S100β和iNOS蛋白表达. 结果： MCAO后3 d，天麻素组大鼠脑梗死边缘区TUNAL+细胞数目明显减少（Plt;0.05）；S100β和iNOS+细胞数目下降（Plt;0.05）. 结论： 天麻素可以抑制脑缺血诱导的细胞凋亡，具有神经保护作用；S100β和iNOS蛋白表达的下调可能涉及到天麻素的抗细胞凋亡作用. 【关键词】 天麻素；脑缺血；细胞凋亡；S100β；iNOS 0引言 脑血管疾病的病理生理过程是非常复杂的，涉及到兴奋性毒性、一氧化氮(NO)蓄积、钙超载、氧自由基损伤、能量代谢障碍、凋亡、胶质细胞异常等. 脑缺血后神经元死亡存在坏死和凋亡两种方式. 抑制凋亡过程，挽救缺血性半暗带内的神经元，防止半暗区向梗塞区的 发展 逐渐成为脑缺血保护剂 研究 的热点［1］. 研究发现天麻素的神经保护作用与抑制细胞凋亡有关［2］. 本实验的目的是通过研究天麻素对暂时性大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠的细胞凋亡和S100β以及iNOS蛋白表达的 影响 ，探讨天麻素的神经保护作用机制. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SpragueDag/kg）腹腔注射麻醉，分离暴露右侧颈部血管，40缝合线结扎颈外动脉和颈总动脉，将一头端加热呈光滑球形并覆有多聚赖氨酸（sigma）的30单股尼龙线（购于宁波医用缝针厂）缓慢插入颈内动脉至感到有轻微阻力为止(约距颈总动脉分叉处17～18 mm),闭塞MCA起始部. 手术期间使用电热毯维持大鼠体温在36.5～37.5℃. 大鼠拔线后分为天麻素组（n=4）和对照组（n=4）. 天麻素组大鼠按100 mg/kg腹腔内每日注射天麻素注射液（中山市三才医药集团有限公司）1次，连续3 d. 对照组大鼠注射同体积的生理盐水. 所有大鼠放回笼中常规喂养. 1.2方法 1.2.1神经学的评价大鼠MACO后2 h参照Bederson等(1986)方法进行神经功能损伤程度的评定. 即0级: 行为正常；1级: 提尾悬空左侧前肢屈曲，肩内收；2级： 抵抗对侧推力下降，伴前肢屈曲；3级: 自发性侧向旋转或运动，伴抵抗对侧推力下降和前肢屈曲. 将评定为3级的大鼠视为成功MCAO模型，用于后续实验. 成功MCAO模型大鼠经水合氯醛麻醉后，轻轻抽出尼龙线，建立MCA再循环. 1.2.2TUNEL和免疫组织化学染色及 分析 天麻素组和对照组大鼠于MCAO后3 d水合氯醛深麻，常规灌注、取脑、固定、石蜡包埋，冠状位切片，片厚6 μm，用于TUNEL染色、S100β和iNOS免疫组织化学染色. 1.2.3细胞计数每只大鼠各取4张TUNEL, S100β和iNOS染色切片，通过Motic Images Advanceed 3.0图像分析系统，使用×20物镜在缺血边缘区选取4个(640×480像素)等面积视野区，计数TUNEL, S100β和iNOS阳性细胞. 统计学处理： 计量数据均用x±s表示，两组间比较采用t检验，Plt;0.05为有统计学差异. 2结果 2.1缺血边缘区TNNEL阳性细胞的形态和数目变化MCAO后3 d在缺血侧半球可见许多TUNEL阳性细胞环绕在梗死区周围，散在分布于正常细胞中（图1）. 而天麻素组缺血边缘区凋亡细胞数目(18.42±2.43)较对照组（23.53±3.36）减少(Plt;0. 05). 图1MCAO大鼠（A）和天麻素 治疗 MCAO大鼠（B）缺血边缘区TUNEL免疫反应阳性细胞TUNEL ×200 2.2缺血边缘区S100β阳性细胞的形态和数目变化免疫组织化学染色显示，对照组大鼠MCAO后3 d S100β阳性细胞在缺血中心区消失，在缺血边缘区出现大量胞体肥大呈圆形的S100β阳性细胞，突起较多且长. 天麻素治疗组大鼠在缺血边缘区也可见许多的S100β阳性细胞，但数目较少（图2）. S100β阳性细胞定量分析显示对照组组为18.92±2.37，天麻素组为14.64±3.11，天麻素组少于对照组，差异有统计学意义(Plt;0. 05). 图2MCAO大鼠（A）和天麻素治疗MCAO大鼠（B）缺血边缘区S100β免疫反应阳性细胞SABC ×200 2.3缺血边缘区iNOS阳性细胞的分布和数目变化免疫组织化学染色（图3）显示，各组大鼠MCAO后3 d在缺血侧脑可见许多iNOS阳性细胞，主要集中于梗死区周围. 在天麻素组iNOS阳性细