联合碳化公司UCARSAN 4256消毒剂抗禽喉气管炎病毒及鸡马立克氏病毒效果测试.docVIP

　　联合碳化公司UCARSAN 4256消毒剂抗禽喉气管炎病毒及鸡马立克氏病毒效果测试 联合碳化公司UCARSAN 4256消毒剂抗禽喉气管炎病毒及鸡马立克氏病毒效果测试 1 实验目的 　　本实验旨在测评联合碳化公司UCARSAN 4256消毒剂的抗禽喉气管炎病毒和鸡马立克病毒的效力。其方法是用稀释的消毒剂产品液对有病毒附着的污染物体硬表面消毒。本实验模拟使用并遵照美国国家环境保护局（EPA）指南，按照EPA实验室工作规范（美国联邦法规汇编第40章第160节）进行操作。 　　2 实验材料和方法 　　2.1 病毒 　　禽喉气管炎病毒来自位于美国斯托斯巴克斯特路67号的斯帕法斯公司（SPAFAS）。 　　马立克氏病毒（ATCC VR-2175）来自美国标准菌种库。 　　2.2病毒培养细胞系 　　鸡胚肾（Chicken Embryo Kidney，CEK）细胞系。 　　次代鸡胚成纤维细胞（Secondary chicken Embryo Fibroblasts，CEF）。 　　2.3 活性成分 　　测试产品中的活性成分为戊二醛。 　　2.4 中和剂 　　试验用中和剂：加热灭活的胎牛血清。 　　2.5 接触时间 　　病毒与测试产品的接触时间5 min。 　　2.6 接触温度 　　接触温度20 ℃plusmn;2 ℃。 　　2.7 测试用试剂 　　磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）。 　　Eagle极限必需培养基稀释培养基。 　　基本Eagle培养基添加5 %胎牛血清（次代鸡胚成纤维细胞生长培养基）。 　　基本Eagle培养基添加8 %胎牛血清（鸡胚肾细胞生长培养基）。 　　基本Eagle培养基添加2.5 %胎牛血清（次代鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾维持培养基）。 　　1 200 mg/kg AOAC合成硬水。 　　2.8 测试条件 　　取2份测试消毒剂UCARSAN 4256消毒剂，用其灭活在玻璃培养皿表面已干燥的攻毒用病毒。在接触一定时间后，从培养皿表面刮取消毒本文由.LicrobioTest公司培育。病毒培养基在滴定和冷冻后用液氮贮藏。 　　3.2 载体制备 　　皮氏玻璃培养皿置于180 ℃下干热灭菌2 h，随后在室温下冷却、贮藏备用。 　　3.3 测试材料制备 　　测试消毒剂按照UCARSAN 4256消毒剂标签说明进行制备。 　　3.4 测试 　　含有5 %有机土的冷冻病毒接种物在测试当天解冻（也可使用新鲜培养基）。每份接种物各取其中一小份喷洒在3个32平方英寸的无菌皮氏培养皿表面（60-mm），随后在室温下放置20～40 min以使其干燥。干燥后的接种物按照试验发起人提出的要求或标签说明加入消毒剂。培养板置于（20plusmn;1）℃环境中，放置时间由试验发起人确定。每份培养板进行相同处理。 　　接触5 min后，接种物/消毒剂混合的用细胞刮棒从培养皿的表面刮下，集中后进行中和。 　　收集洗出液，用合适的细胞培养物稀释培养基进行10倍的倍比稀释。 　　3.5 细胞培养 　　特选的稀释液加入单层宿主细胞的培养基中（每份稀释液设4个孔），随后在（37plusmn;2） ℃和CO2含量 （5plusmn;1） %的环境下培养至病毒吸收（病毒悬垂）为止。 　　病毒吸收后，去掉该稀释液。该单层细胞用磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）冲脱，随后用细胞培养维持液再次培养。该培养基按照上述方式孵育，并在特定时间内观察病毒特异性细胞病变效应（Cytopathogenic Effect，CPE）。不会产生CPE的病毒将用使用人O型血、鸡和/或豚鼠红细胞的标准血细胞吸附/红血球凝聚分析法进行评估，记录观察结果。 　　3.6 实验对照组 　　3.6.1 每种病毒将在测试的时间内进行滴定，以确定病毒传染性。 　　3.6.2中和剂效力对照滴定将利用测试化合物-中和剂-病毒混合液进行。滴定结果将与PBS-病毒的对照混合液滴定结果进行对比。这将证明该中和反应方法的效力。此步骤可在测试前进行。 　　3.6.3 细胞毒性对照滴定将利用测试材料-中和剂混合液进行，以检测添加宿主单层细胞的检测材料的细胞毒性。此步骤可在测试前进行。 　　3.6.4 用无菌玻璃棒把病毒接种物涂在灭菌的皮氏玻璃培养皿表面，在室温下放置30～60 min，使其自然干燥。干燥后加入2 mL PBS。该培养板采用与测试培养板相同的条件进行孵育。该混合物从培养皿的表面刮下按早先介绍的方法进行中和和滴定。此对照将证实在干燥后该病毒的感染性和可恢复的滴度（PBS培养板分离对照）。 　　3.7 计算方法 　　每一个测试组和对照组的平均CCID50/ mL值将通过Reed-Muench法，利用稀释培养板进行测定。 　　4 产品评估标准 　　根据环境保护局（EPA）的规定，如果所有稀释液中的病毒完全灭活得到证明，该检测化