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[2017年整理]云师大植物生理学
本科学生综合性实验报告
学号: 114120146 姓 名: 段霞飞
学院: 生命科学学院 专业、班级:11级生物科学C班
实验课程名称:光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱
及含量的测定
教 师: 李忠光
开 课 学 期: 2013 至 2014 学年 第二 学期
填 报 时 间: 2014 年 4 月 21 日
云南师范大学教务处编印
一.实验设计方案
实验序号 实验二 实验名称 光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定 实验时间 2014年3月、4月 实验室 睿智3栋 428 (一)实验目的
1、掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。
2、掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。
3、掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。
(二)实验原理及实验流程或装置示意图
I 光合色素的提取与理化性质:
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂,如丙酮、乙醇等。
提取液中无任何电子受体,因此可以观察荧光现象。
离体叶绿素在有氧气和光照条件下,发生光氧化作用,结构遭到破坏,形成加氧叶绿素等产物。
叶绿素是一种双羧酸酯,可以发生皂化反应。
叶绿素分子中Mg2+与仆啉环结合不稳定,可以被H+、Cu2+、Zn2+等离子所取代。
II 光合色素的分离与吸收光谱:
光合色素能溶于具有一定极性的有机溶剂,如丙酮、乙醇等。
不同光合色素的分子量、分子结构、极性、溶解度、支持物对它们的吸附力等不同,因而分配系数不同,故彼此可以分开。
叶绿素的卟啉环结构对光有很强的吸收,主要是红光和蓝紫光。
III 光合色素含量的测定
混合液中的两个或多各组分,只要它们的光谱吸收峰不互相重叠,仍然可以根据Lambert-Beer定律(A = k L C)求出各组分含量。Lambert定律:A = k L;Beer定律A = k C。叶绿素a、b在80%丙酮溶液中的Amax分别为663nm、645nm,由此得出:见推导过程
Ca = 12.7 A663 – 2.69 A645;Cb = 22.9 A645 – 4.68 A663
Ca+b = 8.02 A663 + 20.20 A64 (三)实验设备及材料
1、主要实验用具和仪器
研钵、试管、滤纸﹑三角瓶﹑天平﹑滤纸条﹑分光光度计﹑离心机﹑离心管﹑A4纸﹑吸管。
2、药瓶和试剂
CaCO3﹑石英砂﹑丙酮﹑20%KOH甲醇溶液﹑苯﹑50%醋酸﹑醋酸铜粉末﹑四氯化碳﹑80%苯丙。
3、实验材料:植物绿色叶片
(四)、实验方法步骤
I 光合色素的提取与理化性质
光合色素的提取:将植物叶片洗净并用滤纸洗干,准确称取2 g,放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮,充分研磨,再加入10 ml丙酮,研磨,静止片刻,上清液过滤于三角瓶中,待用。
观察荧光现象:与光线垂直的方向观察色素颜色。
光破坏作用:1ml色素提取液于室内,1ml于太阳光下,30min后观察颜色变化。
皂化反应:取一支试管,加入色素提取液2.5ml,再加入30%KOH甲醇溶液1ml,摇匀,再加入苯2.5ml,轻轻摇动,沿试管壁慢慢加入自来水1ml,轻轻摇动后观察,注意观察整个过程颜色的变化。
取代反应:取一支试管,加入3ml色素,逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半,加入少许醋酸铜粉末,酒精灯上加热,与另一半比较颜色的差异。
吸收光谱的变化:皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析。
II 光合色素的分离与吸收光谱
光合色素的提取:将植物叶片洗净并用滤纸洗干,准确称取2 g,放入研钵中并加入少许CaCO3和石英砂及5 ml丙酮,充分研磨,再加入10 ml丙酮,研磨,静止片刻,上清液过滤于三角瓶中,待用。
光合色素分离:剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂:石油醚:丙酮:苯=10:2:1。
吸收光谱的测定:
光合色素的吸收光谱:取色素溶液1 mL,加入丙酮3 mL,摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。
各色素的吸收光谱:上述层析出的3~4种色素,分别剪下后溶于3 mL丙酮中,按上述方法扫描。
III 光合色素含量的测定
方法一:快速测定法
由于叶绿素a、b
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