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2017-05-06 发布于河南
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定量PCR步骤.ppt

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定量PCR步骤

生物学方面的误差：IPC校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等物理方面的误差：ROX校正枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等其余的误差：统计校正重复实验，取平均值相对定量的误差校正 Xn=X0×(1+Ex)n Ex=ER Folds=2 –ΔΔCt ΔΔCT =(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4) Ct1:处理样品待测基因的临界循环数 Ct2: 处理样品持家基因的临界循环数 Ct3: 对照样品待测基因的临界循环数 Ct4: 对照样品持家基因的临界循环数 ΔΔCT法 Real Time RT-PCR反应以RNA为起始实验材料； One Step RT-PCR和Two Step RT-PCR的选择； Real Time PCR反应以DNA为起始实验材料 Real Time PCR方法的选择 Real Time PCR方法的选择探针法染料法 SYBR Green I ROX FAM TaqMan TaqManMGB 双探针(Dual-oligo FRET pairs) 分子信标(Molecular beacons) Real Time PCR方法的选择 Dye Excitation maximum (nm) Emission maximum (nm) Fluorescein 490 513 FAM 494 518 SYBR Green I 494 521 JOE 520 548 VIC 538 552 Cy?3 552 570 TAMRA 560 582 ROX 587 607 Texas Red 596 615 Cy5 643 667 染料的选择探针荧光标记物选择 Real Time PCR方法的选择 Realtime理论操作过程样本RNA 反转录预混试剂反转录温育 PCR扩增试剂 PCR扩增检测结果样本RNA 反转录预混试剂 PCR扩增试剂反转录温育和PCR扩增结果两步法RT－PCR 一步法RT－PCR Realtime PCR PCR扩增试剂样本DNA 结果 Realtime的操作程序 RT primer的选择 Realtime PCR引物和探针的设计 Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同普通PCR引物目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。 Real Time PCR引物目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。 Realtime PCR用引物设计原则好的引物需要寻找好的参照序列 RefSe