第十三章抗体库.ppt

第十三章 抗体库 单克隆抗体技术是生物技术发展的一个里程碑，在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯等方面显示出重要作用和广阔的应用前景。然而在体内的应用，由于是异源性蛋白易引起人抗小鼠抗体反应，影响应有的疗效。 在小鼠杂交瘤技术建立不久，就开始了人杂交瘤技术的研究，但历经20多年这项技术尚未获得真正的突破，其主要原因有： 1.难于获得稳定分泌人抗体的杂交瘤细胞。 2.难于获得分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞。 人源抗体的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产量低，人体不能随意免疫等问题。 随着基因工程技术的崛起以及抗体分子遗传学的深入研究，应用基因工程技术改造现有优良的鼠单抗的基因，其着手点在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性，从而创造出新型抗体——基因工程抗体。 eg.将鼠源性单抗可变区与人恒定区基因拼接起来形成的嵌合抗体； 通过置换人源单抗中的CDR区的改形抗体 以连接肽将VH和VL连接起来的单链抗体 抗体库特别是噬菌体展示技术的创建，被誉为又一次革命性进展。由于目前大部分基因工程抗体还是基于小鼠杂交瘤，鼠源蛋白的问题尚未彻底解决。抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，针对制备任何抗原的单克隆抗体。它为人单抗的制备提供了一条非常有效的方法，基因工程抗体的进展已使抗体的制备和应用进入了又一个全新的时代。 噬菌体展示技术的形成： 1982年，Dulbecco首次提出源于致病因子的具有免疫原性的外源抗原决定簇或多肽可以在噬菌体或其它病毒表面被展示的概念。 1985年，Smith第一次证实丝状噬菌体fd的基因组能够通过基因工程手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋白融合并同时展示在噬菌体表面。 1990年，Smith小组又证明展示的抗原决定簇能被相应的抗体所识别，从而创建了噬菌体展示技术。 丝状噬菌体的生物学特征： 丝状噬菌体主要包括大肠杆菌丝状噬菌体M13、fd、f1等，它们的亲缘关系十分密切，特征相似，都包含一个单链环状DNA分子，DNA同源性高达98%。这种噬菌体只能通过大肠杆菌的性菌毛才能将其DNA注入细菌，因此它只侵染含F因子的雄性大肠杆菌。 噬菌体展示技术是将目的基因与编码噬菌体外壳蛋白基因相连，并插入到噬菌体表达载体，使多肽或蛋白与其外壳蛋白氨基端融合并展示在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。 从表达各种各样外源蛋白的噬菌体群体（库）中筛选出带有特异外源蛋白的重组噬菌体，一般采用亲和筛选，即利用在噬菌体表面上展示的多肽可以与特定的选择体进行亲和结合，从而得以分离。 先将选择体固相化，然后使文库中重组噬菌体所展示的目的多肽与固相化选择体亲和结合，通过洗脱就可以收集到带有目的多肽或蛋白的重组噬菌体，并可利用噬菌体再感染大肠杆菌得以进一步扩增。通过一轮亲和结合—洗脱—扩增，即所谓淘筛的过程，可以使噬菌体富集约100~1000倍，经过几轮淘筛可以从噬菌体文库中筛选到带有目的基因的重组噬菌体。 噬菌体展示的重要意义在于： 1.被选择的多肽展示在噬菌体表面，在获得多肽的同时也得到了编码该多肽的基因序列； 2.亲和选择可以得到亲和力强的重组噬菌体，整个过程与动物体内抗原对抗体克隆选择原理相同。 噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体抗体库构建和单克隆抗体的筛选。将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白Ⅲ融合，使之表达于噬菌体颗粒的表面，这就形成了噬菌体抗体。将全套的抗体可变区基因设计适当引物克隆出来，组建到表达载体内，再表达到许多噬菌体颗粒表面，则得到噬菌体抗体库。它可以使人们在体外模拟体内抗体产生过程，制备出针对任何抗原的单克隆抗体。 噬菌体展示肽库构建原理图 合成随机片段 载体噬菌体 RF DNA或噬菌粒 PCR扩增 酶切 目的片段 连接 插入外源基因的噬菌体DNA 或噬菌粒DNA 多次电转化大肠杆菌 转化菌 肽库 培养产生病毒子 辅助噬菌体侵染 噬菌粒肽库 天然抗体库和抗