病原生物学实验技术ppt内容整合教程.docx

病原生物学实验技术课程内容实验一细菌的分离培养和保存1.菌种的保存目的：①科研：保证研究结果具备良好重复性；②生产：制备诊断抗原和免疫血清；③实验：质控所必需，新配置的试剂需要用标准菌株来做质控。2.菌种保存的原理：使其生长繁殖受到抑制的休眠状态，减少菌种的变异。3.菌种保存原则：①长期保证菌种原有性状和活力不变；②考虑保存方法的简便和经济。4.菌种常用措施：①降低培养基营养成分；②低温、干燥、缺氧、避光；③添加保护剂。5.菌种保存方法（保存方法、使用范围、优缺点）⑴传代培养保存法：优点：不需要很特殊的设备，操作容易，可随时观察细菌是否存活，是各微生物实验室采用的基本保存方法。缺点：①保存期限短：需经常传代，易发生变异和杂菌污染；②细菌活力易受影响：培养基成分、温度的微小变化；③需定期移种：保管多种菌株时费力、费用高，占用地方多。防止变异的措施①控制传代次数：避免不必要的移种和传代；②用典型菌落传代：每次传代时，可用平板划线分离的方法；③选择合适的培养条件：选择一个适宜原种生长的条件可以防止菌种的衰退；④选择合适的菌种保存方法：需要长期保存，应采用冻干法或液氮保存：半固体穿刺法：适用于大多数对营养要求不高的细菌。保存期限2个月。斜面保存法：广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的短期保存。放线菌、霉菌和有芽胞的细菌2－4个月，无芽胞细菌1个月，酵母菌2个月，假单胞菌半个月液体保存法：适用于厌氧菌（庖肉培养基）、链球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、钩体等。厌氧芽胞杆菌约2个月，无芽胞的细菌约3周液体石蜡保存法：适用于保存真菌、酵母菌和放线菌，对保存细菌的效果较差。方法：在培养成熟的菌种斜面上，加入灭菌并已将水分蒸发掉的液体石蜡，油层高过斜面末端1cm，封口后以直立状态在室温或4℃冰箱保存。保存期可达数年。注意恢复使用时，由于菌体外仍粘有石蜡油，故生长较慢，且有粘性，一般要再移种2~3次才能得到良好的菌种。⑵低温保存法保存期限约一年，有些菌种可长达10年对容易死亡的无芽胞厌氧菌特别适用，大多数能存活数年，对放线菌的保存也很有效在实际应用中，本法比冷冻干燥法更为方便注意事项：①用此法保存细菌，菌浓度较高时，生存率高，保存期长；②冷冻保存菌融化后，不能继续低温保存，应重新制作菌悬液后再低温保存。⑶冷冻真空干燥法原理：低温下快速将微生物细胞或孢子悬浮液冻结，然后在真空状态下使水分升华将样品干燥，使微生物处于休眠状态，得以长期保存。除了只生菌丝不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用此法。步骤：优点：同时具低温、干燥、缺氧的菌种保存条件，无需经常传代，保存时间长，存活率高，变异率低，是目前最有效的菌种保存方法之一。缺点：操作繁琐，技术要求高，需要的设备较昂贵，一般的实验室较少使用。⑷液氮超低温保存法原理：让生物细胞在液氮超低温的状态下冻结，为减少超低温冻结时所造成的损伤，要先将生物细胞悬浮在合适的保护剂中。常用保护剂：羊(兔)全血，10%(20%)甘油，10%二甲基亚砜优点：适用范围最广，可保存病毒、噬菌体、立克次氏体、各种细菌、放线菌、真菌、螺旋体、丝状菌甚至动物细胞，操作简便，保存效果好，保存期限长，是目前最有效的菌种长期保存技术之一缺点：液氮消耗量较多6.菌种保管的注意事项①菌种经鉴定后，选用适当方法及时保存；②标签牢固（编号、代次，批号，日期）；③不同属或同属的强弱毒株不可同时在同一无菌室内操作；④保存范围、转移、销毁要遵守卫生部规定；⑤专人负责，每种一卡。7.细菌的分离培养临床常见标本初分离细菌应选用的培养基种类8.细菌的接种方法①平板划线法：从混合培养物中分离单个菌落分区划线法（含菌量多）连续划线法（含菌量少）②斜面接种法：纯化培养和保存菌种③穿刺接种法：保存菌种和观察动力④液体接种法：肉汤增菌和糖发酵试验⑤涂布接种法：菌量计数和药敏试验9.细菌的培养方法①需氧培养：用于各种需氧菌和兼性厌氧，细菌检验中最常用的方法。②CO2培养法：用于分离培养需要CO2气体生长的细菌，脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌、淋球菌，烛缸法。③厌氧培养：用于分离培养专性厌氧菌，焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧袋法、厌氧箱培养法等。实验二病毒基因组遗传进化分析1.病毒的进化：病毒的由来、存在及其发展演变的过程、特征和规律。2.研究病毒进化的难度：病毒特别微小；病毒没有化石；病毒进化的随机性强。3.病毒（Virus）是形态最微小、结构最简单的微生物。因其体积微小，必须用电子显微镜放大几万至几十万倍后方可观察；结构简单表现为无完整的细胞结构，仅有一种类型核酸（RNA或DNA）作为其遗传物质。特点：从进化的角度来说,病毒是高度的进化的生物,并仍在不断的进化。病毒一般只编码从宿主细胞中不能得到的功能,除功能基因外很少浪费基因组序