舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应.docVIP

　　舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应 作者：郑佳冰, 黄立峰, 许盈, 俞昌喜 【关键词】 眼镜蛇毒液类;,受体,胆碱能;,毒蕈碱;,胆碱能激动剂;,放射受体 分析 法 　　摘要: 目的 从舟山眼镜蛇Naja atra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系。 方法 应用 分子筛凝胶Sephadex G50、Sephadex G100、离子交换凝胶CMSepharose F.F.分离纯化目的组分;SDSPAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应。结果 从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(Ki为10.12 nmol/L),其相对分子质量约14 kD。该多肽可引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断。结论 舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该多肽对M胆碱受体具有激动效应。 　　关键词: 眼镜蛇毒液类; 受体,胆碱能; 毒蕈碱; 胆碱能激动剂; 放射受体分析法 　　ABSTRACT: Objective To isolate muscarinic peptide(MP) from Naja atra venom and to study the effect of MP in muscarinic cholinergic receptor(mChR). Methods MP had been isolated and purified from Naja atra venom by gel filtration on Sephadex G50 and Sephadex G100, chromatography on ionexchanger CMSepharose FF. Homogenicity and molecular ined on SDSPAGE. Isolated ileal longitudinal muscles of the guinea pigs ChR. The affinity of MP to rat brain synaptosomal membrane Naja atra venom could displace [3H]QNB from rat brain. Its molecular , MP produced a potent contraction uscarinic peptide from Naja atra venom uscarinic agonist. 　　KEY 胆碱受体有亲和力的毒蕈碱样毒素(muscarinic toxins,MT)――MT1和MT2[2],此后,陆续发现其他的MT。迄今为止,从曼巴蛇毒中至少分离得到12种类似的神经毒素[25], 研究 发现MT对M胆碱受体亚型选择性较高,在药理和生理研究中是一种很好的工具药。我国蛇种舟山眼镜蛇与曼巴蛇同属眼镜蛇科,笔者拟从舟山眼镜蛇蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,并观察其与M胆碱受体的关系。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 蛇毒 　　舟山眼镜蛇蛇毒,广州新源蛇毒生产基地提供。 　　1.1.2 试剂与仪器 　　Sephadex G50、Sephadex G100和CM Sepharose FF(美国Amersham公司);[3H]QNB,48 Ci/mmol,1.0 mCi/mL(美国Amersham公司);其他试剂均为国产分析纯;GF/C玻璃纤维滤膜(英国D公司)。 　　1.1.3 动物 　　SD大鼠,体质量(250~280 g),雌雄不限(合格证号:闽实动质准第002205);荷兰种豚鼠,体质量250~300 g,雌雄不限,福建医科大学实验动物中心提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 蛇毒的分离纯化 　　舟山眼镜蛇粗毒溶于双蒸水中,4 ℃静置过夜;4000 r/min离心10 min,取上清液上Sephadex G50柱(26 mm×900 mm),用双蒸水进行洗脱,流速20 mL/h,部分收集器收集洗脱液,每管10 min,测定洗脱液280 nm波长处的光密度值[D(280 nm)],绘制洗脱曲线。活性组分经浓缩脱盐后,上Sephadex G100柱(26 mm×900 mm),洗脱过程同上。活性组分经浓缩脱盐后上离子交换凝胶CM Sepharose FF,用0.02 mol/L、pH 8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)及NaCl(0.05~0.6 mol/L)进行阶段性梯度洗脱,洗脱过程同上。整个分离过程均在低温层析箱内进行。 　　1.2.2 纯度鉴定 　　参照 　　1.2.4.2 饱和实验