TOCP对人成神经瘤SH-SY5Y细胞PKC活性及转位的影响.pdfVIP

TOCP 对人成神经瘤SH-SY5Y 细胞PKC 活性及转位的影响 研究生：江 岚 导 师：龙鼎新 教授 专 业：卫生毒理学 中文摘要 目的： 研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP ）同时结合应用工 具药蛋白激酶C （Protein kinase C ，PKC ）激活剂佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA ）和PKC 抑制剂星胞菌素（staurosporine，SP ）处理人成神经 瘤细胞 SH-SY5Y 不同时间后，观察细胞中PKC 的活性、PKC 转位及表达的影 响，为解释TOCP 毒害作用奠定基础，拓宽对TOCP 致神经毒性的认识，而且有 助于进一步理解和揭示神经退行性病变的机理具有重要的理论意义。 方法： 1. 以人成神经瘤细胞系SH-SY5Y 细胞为实验材料进行培养，使用TOCP （0，0.25，0.5，1.0 mmol/L）进行染毒，染毒时间12，24 和48 小时。通过普 洛麦格公司的PKC 活性检测试剂盒检测PKC 的活性。根据PKC 活性的检测 结果，进一步结合使用工具药PKC 激活剂PMA （0，25 ，100 nmol/L）和PKC 抑制剂SP （100 nmol/L）作用SH-SY5Y 细胞，染毒12，24 和48 小时后分别 检测细胞内PKC 的活性。 2 ．同上条件，以TOCP 及工具药PMA 和SP 作用SH-SY5Y 细胞后，间接 免疫荧光技术检测 PKC 在细胞内的定位，荧光倒置显微镜观察结果。 3 ．同上条件，以TOCP 及工具药PMA 和SP 作用SH-SY5Y 细胞后，Western III 万方数据 blotting 检测胞膜PKC α、PKC βI、PKC βⅡ、总PKC 和总PKC 磷酸化蛋白的 表达。 结果： 1. 0.5 mmol/L TOCP 作用于SH-SY5Y 细胞24 小时，PKC 蛋白磷酸化水平发 生变化，磷酸化PKC 蛋白增多；1.0 mmol/L 作用细胞12 小时和24 小时，随着 TOCP 染毒时间的延长，磷酸化 PKC 蛋白逐渐增多；对凝胶电泳条带进行灰度 扫描并进行统计学分析，结果发现，0.5mmol/L TOCP 染毒24 小时以及1.0 mmol/L TOCP 染毒12 和24 小时，细胞内磷酸化PKC/非磷酸化PKC （p-PKC/PKC ）灰 度比值与对照组比较有统计学意义（P0.05 ），并且TOCP 染毒浓度高，染毒时 间长均可见p-PKC/PKC 增加。提示，在实验组的染毒剂量中，1.0 mmol/L TOCP 作用SH-SY5Y 细胞24h 诱导PKC 活性最强。100 noml/L PMA 作用SH-SY5Y 细 胞12 小时，100 noml/L SP 作用SH-SY5Y 细胞12 小时，PKC 蛋白磷酸化水平发 生变化，磷酸化PKC 蛋白增多；100 noml/L PMA 作用SH-SY5Y 细胞24 小时和 48 小时，100 noml/L SP 作用SH-SY5Y 细胞24 小时和48 小时，随着PMA 作用 时间的延长，磷酸化PKC 蛋白逐渐增多；对凝胶电泳条带进行灰度扫描并进行 统计学分析，结果发现，25noml/L PMA 作用SH-SY5Y 细胞24 小时和48 小时 以及100 noml/L PMA 作用SH-SY5Y 细胞12、24 小时和48 小时，和100 noml/L SP 作用S