贴壁生长与悬浮生长树突细胞的免疫学功能比较.docVIP

　　贴壁生长与悬浮生长树突细胞的免疫学功能比较 作者：刘朋飞 朱磊 李响 葛超卓 周余来 【摘要】 　　目的 探索树突细胞（DCs）的可能生长状态，比较分析不同生长状态DCs的免疫学功能。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞，用不同培养介质常规培养2 h，取贴壁细胞，用含细胞因子的培养液进行培养，在培养过程中光镜下对其进行形态鉴别，然后检测两种DCs促淋巴细胞增殖和诱导免疫反应的功能。结果 7 d后，培养瓶中DCs基本处于悬浮状态，而培养板中DCs基本处于贴壁状态；培养瓶中DCs与培养板中DCs形态与理论相符，但培养板中DCs分化形态优于培养瓶中DCs。而在体外促进淋巴细胞增殖及体外诱导免疫反应方面，培养瓶中DCs的能力优于培养板中DCs。结论 在DCs体外培养至发育成熟的过程中，DCs先贴壁后悬浮的生长性质可能对其免疫学功能有着重要意义。 【关键词】 树突细胞；细胞培养；生长状态；免疫学功能 　　树突细胞（dendritic cells，DCs）是目前所知抗原呈递功能最强大，并且是惟一能激活初始性T细胞的抗原提呈细胞，所以，它是特异性免疫应答的始动者，在机体免疫应答中发挥着重要作用〔1，2〕。近年来，对于DCs的生物学特点及参与免疫应答的机制研究较多，由于老年人体内DCs抗原呈递功能下降，减弱了机体免疫防御及免疫监视作用，使老年人易患感染、肿瘤等多种疾病，所以，DCs在老年病研究中的地位越来越受到重视〔2〕。在体外进行DCs培养时，一般认为DCs贴壁生长一段时间后，会处于半贴壁或悬浮生长状态，所以在培养最后取悬浮细胞作为成熟DCs〔3～6〕。而不同培养介质所培养的DCs生长状态，国内外未见报道。本实验旨在探讨不同培养介质所培养DCs的生长状态，在形态和免疫学功能方面是否有所差异，为不同类型DCs的形态学和功能学鉴别提供重要依据，也为成熟DCs的分离培养方式提供一定的理论 参考 。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 重组人粒细胞 　　巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF）、重组人白细胞介素4（rhIL4）均购自美国Peprotech公司，重组人白细胞介素2（rhIL2）购自山东泉港药业有限公司，MTT购自美国GenViea公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品有限责任公司，RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司，Rosettsep T细胞富集试剂盒购自加拿大Stemcell公司，人结肠癌colo205细胞株由吉林大学药学院生物工程实验中心提供，人外周血由健康志愿者提供。 EXL808酶标检测仪购自美国宝特公司，Olympus IX70倒置显微镜购自日本Olympus公司。 　　1.2 人外周血DCs的分离与培养 　　取健康志愿者外周静脉血40 ml，肝素抗凝，加入等体积PBS稀释后，经淋巴细胞分离液(Ficoll)梯度离心(2 000 r/min，20 min)；取界面细胞，置于15 ml离心管中，用PBS溶液悬浮细胞，1 500 r/min离心5 min；弃上清，如此反复洗涤细胞3次，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基悬浮细胞。以2.4×106个/ml的细胞浓度加入48孔培养板和培养瓶中，孵箱培养2 h；吸弃上清，用PBS洗2次，洗去非黏附细胞，获得贴壁细胞；再加入含有500 U/ml rhGMCSF和500 U/ml rhIL4的新鲜培养基，于37℃、5% CO2条件下培养。用含相同浓度细胞因子的培养基隔天半量换液1次，倒置显微镜下观察细胞生长和形态。 　　1.3 肿瘤相关抗原的制备 　　培养一段时间后，取一定量结肠癌细胞用PBS洗涤3次，调整细胞浓度为2×107个/ml，分别于液氮与37℃水浴之间反复冻融3次；12 000 r/min离心30 min，收集上清液，用220 nm微孔滤膜过滤后，即为肿瘤相关抗原。于-70℃保存备用。 　　1.4 DCs的抗原负载 　　于DCs培养的第8天，用胰蛋白酶消化培养板中细胞，并进行细胞计数，接种到48孔板中。培养瓶中DCs处于悬浮状态，可直接计数。按DCs与抗原的比例为1∶5进行抗原负载，抗原加入量以冻融前肿瘤细胞的量计，并设置未进行抗原负载的对照组，观察抗原负载后DCs的生长状态。 　　1.5 静脉血T细胞的提取 　　取志愿者新鲜静脉血8 ml（用0.1%肝素抗凝），加入0.4 ml Rosettsep试剂（50 μl/ml静脉血）混匀室温静置20 min，PBS稀释后加入等体积的淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸出 T细胞层，再用PBS清洗2次，收集、备用。 　　1.6 DCs对T淋巴细胞的促增殖作用 　　在抗原负载48 h后，取T淋巴细胞，经台酚蓝染色后检测细胞活力，进行