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MTT步骤
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
2008-06-12 10:33
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项
MTT原理
MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4
,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源
性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜
(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数
量。在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活
性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经
济。 缺点:由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加,也
会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法??? 通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此,可以称取MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)或
无酚红的培养基中,用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过
程中,容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。??? 需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检
测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配,过滤后4ordm;C避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避
免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在
EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能
再用了。
MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感;
往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.
配制MTT时用PBS(ph=7.4)溶解。PBS配方:Nacl 8g + Kcl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g
调pH 7.4,定容1L。
普通MTT法实验步骤:1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细
胞接种到96孔板,每孔体积200ul.2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,
终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为
横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤贴壁细胞:1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-
10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,
细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午
加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。4: 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,
可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。5: 终止培养,小心吸去孔内培养液。6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免
疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。7: 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介
质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。
悬浮细胞:1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640(无血清)培
养基40ul ;②加
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