人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达.docVIP

　　人EPO基因真核表达载体的构建及其在人脐血间充质干细胞中的表达 　　2 结果 　　2.1 pcDNA3-EPO真核表达载体的构建 用PCR法扩增EPO cDNA，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，出现一条特异性区带，位于分子质量标准500 bp附近，与预期大小相符（图1）. 将PCR产物克隆至真核表达载体pcDNA3中，重组质粒pcDNA3-EPO经酶切鉴定后，结果证实所插入基因的位置、大小和方向均正确（图2）；测序结果也表明所构建的质粒符合预期设计. 　　2.2 外源EPO基因在人脐血MSCs中的表达 在288 bp处扩增得到特异性目的片段（图3），表明在转染的人脐血MSCs中有特异性的EPO基因的表达. SCs中可检测到EPO蛋白的表达（图4），其蛋白条带位置（34 ku）与阳性对照即人胎肝细胞L02一致，而未经转染的人脐血MSCs无EPO蛋白的表达. 　　1: EPO cDNA ; 2: DNA marker (DL2000). 　　图1 EPO cDNA 的PCR扩增产物（略） 　　1：pcDNA3-EPO的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切； 2：pcDNA3-EPO的EcoRⅠ酶切； 3：pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切； 4：pcDNA3的EcoRⅠ酶切； 5：DNA marker（DL2000）； 6：DNA marker（DL15000）. 　　图2 重组质粒pcDNA3-EPO的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切鉴定（略） 　　1：EPO cDNA片段的PCR产物； 2：DNA marker（DL2000）. 　　图3 外源EPO基因在人脐血MSCs表达的RT-PCR鉴定（略） 　　1：人胎肝细胞； 2：转染EPO基因的人脐血MSCs. 　　图4 外源EPO基因在人脐血MSCs表达的SCs胞质呈棕褐色，为EPO阳性表达；未转染pcDNA3-EPO的人脐血MSCs不表达EPO，胞质为蓝色（图5）. 　　A： 转染； B： 未转染. 　　图5 外源EPO基因在人脐血MSCs中表达的细胞免疫化学鉴定 DAB ×200（略） 　　3 讨论 　　HIE是新生儿时期的常见病， 目前 对重度新生儿HIE尚缺乏特异有效的 治疗 方法 ［5］. 近年报道从新生儿脐血中亦分离到MSCs，发现MSCs不仅可分化成多种中胚层来源的细胞，在一定的条件下亦能分化为神经细胞［2］，移植至脑内后能明显改善受损神经系统的功能［6］. MSCs不仅能向神经细胞分化，而且易于外源基因转染和表达，将外源的神经营养因子基因体外转染MSCs，再移植入脑内，神经营养因子在脑内稳定表达，可以增强MSCs移植治疗的效果［3-4］. 　　EPO是一种新的、作用很强的神经营养因子，不仅可促进神经前体细胞的增殖和分化，减少神经细胞的凋亡；而且能促进血管内皮细胞的成熟和存活，使血管再生，减轻局部缺氧造成的损害［1］. 脑内的EPO和EPO受体的表达受低氧诱导因子的调控，在缺氧缺血条件下，EPO尤其是EPO受体表达明显增加［7］，因此外源的EPO具有很好的治疗缺氧缺血性脑损伤的作用. 然而EPO仅有极少量透过血脑屏障，并且半衰期短，只有大剂量、多次静脉注射才能取到一定的治疗效果［8］，但大剂量静脉注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红再障的风险［9］，而脑内注射尤其是多次脑内注射在临床上是行不通的. 将EPO基因通过移植细胞导入脑内，使其在脑内持续表达，就可以发挥EPO的神经营养和神经保护作用，此即为EPO的基因治疗. 而且脑内的EPO不进入血循环，不会出现红细胞增多和纯红再障等不良反应. 　　我们选择人EPO基因和人脐血MSCs作为靶基因和靶细胞，将人EPO基因转染人脐血MSCs，获得稳定转染人EPO基因的人脐血MSCs，以期作为一种基因修饰干细胞用于移植治疗重度新生儿HIE，起到EPO基因治疗和MSCs细胞治疗相结合的双重作用. 本实验成功构建出了EPO基因真核表达载体，转染人脐血MSCs后经稳定筛选获得了能稳定表达EPO的人脐血MSCs，为EPO基因修饰的人脐血MSCs用于移植治疗重度新生儿HIE奠定了实验基础. 同时因为EPO是一种具有促红细胞生成作用的造血因子，人脐血MSCs尚具有支持造血的功能［10］，因此EPO基因修饰的人脐血MSCs还可用于临床上各种贫血的治疗，对于探索治疗贫血的新方法也具有重要的实用价值. 【 参考