生物化学实验技术4柱层析二.pptVIP

四、离子交换层析 (一) 基本原理 1. 离子交换剂? 离子交换剂是由基质、电荷基团（功能基团）和反离子构成的。 纤维素—O—CH2—COO-—Na+ 2.离子交换方式 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。 RA + B+ RB + A+ 3.选择系数? KAB =[RB][A+]/[RA][B+] [A+]=[B+] KAB = [RB]/ [RA] KAB 1 [RB] [RA] 交换剂对B+亲和力比A+大 KAB = 1 [RB] = [RA] 交换剂对B+亲和力与A+相同 KAB 1 [RB] [RA] 交换剂对B+亲和力比A+小 4、亲和力 离子电荷量、反离子、两性电解质 5.交换过程 平衡阶段、吸附阶段、解吸附阶段、再生阶段 (二)、离子交换剂的分类及其性质 要求、分类 1.疏水性离子交换剂 阳离子交换剂 阴离子交换剂 2.亲水性离子交换剂 （1）纤维素离子交换剂 DEAE—纤维素 CM—纤维素 （2）交联葡聚糖离子交换剂 （3）?琼脂糖离子交换剂 3.性质 （1）?? 颜色与性状 （2）?? 交联度 （3）?? 吸水量或膨胀度（4） 交换容量 (三)、离子交换剂与缓冲液的选择 1.????? 离子交换剂的选择 （1）?? 对阴阳离子交换剂的选择 （2）?? 强弱离子交换剂的选择 （3）?? 对不同离子型离子交换剂的选择 （4）?? 对不同基质离子交换剂的选择? 2.????? 缓冲液的选择 （1）?? 缓冲液组分的选择 （2）?? 缓冲液的离子强度和pH选择 (四)、操作 ⒈离子交换剂预处理和装柱? 溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。 ⒉加样与洗脱? 加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低,上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。 洗脱：改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。 为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。 连续梯度洗脱。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算： C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 　　式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1A2时为凸形梯度。 洗脱时应满足以下要求： ①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。 ②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 ③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。 ⒊洗脱馏份的分析? 按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。 ⒋离子交换剂的再生与保存? （1）再生： 如离子交换纤维素可用2mol/ L NaCl淋洗 柱，若有强吸附物则可用0.1mol/L NaOH洗柱； 若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤。 （2）转型:离子交换剂转上相应的反离子 （3）保存：保存离子交换剂时要加防腐剂。 阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰）， 阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）。 有些产品用0.02％叠氮钠。 ⒌离子交换层析的应用? 离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。 （1）分离氨基酸、 （2）多肽及蛋白质 （3）分离核酸、核苷酸 （4）其它带电荷的