双光子显微术于生物组织的应用.doc

雙光子顯微術於生物組織的應用 李宜真　台灣大學物理系 蘇子正　麻省理工學院機械系 E-mail : b7202004@ms.cc.ntu.edu.tw 傳統上，若要穿透可觀的厚度而獲得生物組織內的細胞生理學資料，切片方法可提供高解析度的影像。但是切片方法每次只能探測一個二維的平面且有可能破壞三維的結構，同時切片的樣品必須經過化學處理及固定，無法觀測活體。以上的缺點都可由改用共焦顯微術與雙光子顯微術而克服。 一、簡介 三維共焦及雙光子顯微術 共焦顯微術使用一個透鏡將入射光源聚焦，以焦點掃描樣品，再以同一個透鏡收集樣品的反射光或受激發所發出的螢光，會聚到另一側的對應焦點上，用一個針孔將焦點以外的光線濾除。共焦顯微術以限制收光的區域達到三維的鑑別。 雙光子顯微術在1990年由Denk等人提出 [1]。此技術與共焦顯微術的基本架構類似，不同的是使用在短時間內發出極高強度光子量的脈衝式雷射，一次以兩個較長波長的光子激發一個螢光分子。由於雙光子激發要求較高的光子量，幾乎沒有焦點外的螢光分子會被激發，故雙光子顯微術無須在另一側的對應焦點上用針孔濾除背景。軸方向的高對比度為雙光子顯微術的最大優點。若使用NA 1.25的物鏡與960 nm的激發光源，螢光總量的80%都來自焦點上下1um的區域。 圖一、雙光子顯微的點散佈函數(point-spread-function)，軸方向的聚焦點寬度為 0.9 um ，徑向方向為 0.3 um。 共焦顯微術和雙光子顯微術都可做三維的顯微，前者可測量兩種來自樣品的訊號：反射或螢光。且因為共焦顯微術使用波長較短的光，聚焦點較雙光子使用的近紅外光子波長較小。但雙光子顯微術有幾個無法取代的優點：(1)在進行深度生物組織掃描時，螢光共焦顯微術通常所使用的藍紫、紫外光易被樣品吸收，只能觀測到大約20 ~ 40um的深度；雙光子螢光顯微術使用的紅外光則比較不易被吸收。(2)雙光子顯微術對樣品的激發侷限在焦點附近，故對樣品及螢光分子可能造成的漂白破壞也只發生在焦點附近，能進行更長時間的重複觀察。1998年Mohler等人將倉鼠胚胎置於雙光子顯微鏡下觀察數小時[2][3]，而此胚胎在移植回子宮發育後仍然能成長為健康的成鼠。(3)雙光子螢光顯微中的激發光與樣品發出的螢光波長相差甚多，較不必擔心為了濾除激發光源而降低訊號。(4)最重要的一點，當觀測本身會散射光線的樣品時，共焦顯微術中不可或缺的針孔不只阻擋了非聚焦點附近的光線，同時也阻擋了部分來自焦點、卻經過散射而無法回到共阨焦點的訊號。雙光子顯微術的三維鑑別是源自於激發範圍的限制，不需要針孔阻擋。 雙光子顯微鏡的架設 圖二、雙光子顯微鏡的架構 雙光子顯微鏡的架構一般皆包含三部分(如圖)：飛秒(fs)等級之脈衝式雷射、高集光效率的顯微鏡系統、高敏感度的光電轉換系統。雷射通常使用鈦-藍寶石雷射，經過兩面反射鏡以在x-y平面上移動聚焦點。 雙光子激發所得到的螢光由高NA值的水鏡收集；此物鏡的有效工作距離同時也大約限制了可能的觀測深度。物鏡與樣品間的相對高度以壓電晶體控制以快速移動。最後將物鏡收集到的螢光通過分光鏡、光纖，進入光電倍增管，光電倍增管轉換出的訊號交由電腦重組出三維的影像。 二、生物組織顯像所使用的螢光分子 雙光子螢光顯微用於生物組織顯像時所使用的螢光分子分為兩種：自體螢光與外加螢光。 自體螢光(Endogenous fluorescence) 生物組織本身通常即含有可以以雙光子激發的螢光分子，胺基酸中的tryptophan和tyrosine都會發光。但是胺基酸的單分子吸收波長大約在 250 ~ 300 nm的範圍，也就是500 ~ 600 nm的雙光子吸收，通常雙光子顯微系統所使用的雷射可用波長並不包括這個波長。且因為胺基酸在生物各部為的分佈密度差異不大，從而得到的螢光分佈也並不是特別有意義。 生物體中常用的高能量分子NADPH與NADH也會產生螢光。獨立的NAD(P)H吸收譜線為340 nm並放出460 nm的螢光，衰滅時間400皮秒。與其他分子結合的NAD(P)H之螢光光譜會藍移，且衰滅時間延長到2奈秒。高新成代謝率的區域因為有高濃度的NAD(P)H，所得影像亮度較高。NAD(P)H的螢光因此可用來監測角膜與皮膚中的氧化還原態。在粒線體中濃度特別高的黃素蛋白(flavoprotein)(生化反應中電子傳遞鍊上的能量分子)也可用於雙光子螢光顯微，其單光子的吸收譜線在450 nm，放出550 nm的螢光。 雙光子顯微術也可觀測細胞外間質，主要為膠原(吸收在280 ~ 300 nm左右，放出350 ~ 400nm)與彈力蛋白(吸收400 ~ 450 nm，放射340 ~ 370 nm)。彈力蛋白可輕易以雙光子顯微觀測，但是膠原蛋白的吸收譜線