浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β.docVIP

　　浅析低氧促进体外培养的星形胶质细胞内β 【摘要】 目的探讨低氧对星形胶质细胞内β-catenin积聚的机制。方法体外分离昆明小鼠海马星形胶质细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养12h和24h后，利用RT-PCR和ethodsAstrocytes Kunming mouse hippocampus in vitro, then cultured in hypoxia and traditional oxygen for 24 hours and 12 hours, respectively. The expressions of EM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多抗购自Sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体、抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体(Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司，SuperSignal EM/F12培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目不锈钢筛网过滤，制备混合细胞悬液;收集于无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。加入含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基，将细胞密度调整为3～5×105个/mL，接种于50mL培养瓶内。置于37℃，饱和湿度，50mL/L CO2培养箱中培养，2～3d后换液。 　　1.2.2星形胶质细胞的纯化及鉴定培养7d后，贴壁细胞融合达90%以上，利用胰酶消化法传代，继续培养，连续传代3次后，所得细胞即是星形胶质细胞。鉴定时，将细胞接种于12孔板内的盖玻片上，3d后取出爬满细胞的盖玻片，进行GFAP免疫细胞化学鉴定(SP法)，步骤简述如下：PBS漂洗，以40g/L多聚甲醛液固定30min;PBS漂洗，5min×2次;30mL/L H2O2孵育5min;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;倾去，勿洗;滴加兔抗GFAP多克隆抗体(1∶100)，置于湿盒内4℃过夜;PBS洗，3min×3次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育60min;PBS洗，3min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS冲洗，3min×3次;DAB显色后脱水，透明封片并镜检。阴性对照将PBS替换一抗，其余步骤相同。 　　1.2.3星形胶质细胞的低氧培养将6孔板内的细胞置于50mL/L O2，50mL/L CO2/N2的低氧培养箱内培养12h和24h后，待细胞密度达80%以上融合后，取出细胞，进行相关指标检测。常氧培养的细胞为对照组，各组细胞各取3孔，分别进行3次实验。 　　1.2.4RT-PCR法检测星形胶质细胞中V反转录酶，4.0μL 25mmol/L MgCl2，4.0μL 5×buffer，加灭菌三蒸水至总体积20μL，42℃ 1h，选定扩增循环数为30。取逆转录cDNA 4.0μL，10×扩增缓冲液5.0μL，MgCl2 3.0μL，dNTP 3.0μL，上、下游引物10pmol，Taq DNA聚合酶1.0μL，加灭菌三蒸水至总体积50.0μL。在PCR仪上扩增，反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃(arker;2、4：常氧组Wnt3、Wnt3a;3、5：低氧组Wnt3、Wnt3a。 2.4, FELDMAN AB, KLESSE LJ, et al. Requirement for nitric oxided activation of p21(ras)/extracellular regulated kinase in neuronal ischemic preconditioning \[J\]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97(1):436-441. 　　\[2\]LEE MY, KIM SY, SHIN SL, et al. Reactive astrocytes express bis, a bcl-2-binding protEin after transient forebrain ischemia \[J\]. Exp Neurol, 2002, 175(2):338-346. 　　\[3\]CHEN Y, SA G, VIJAYARAGHAVAN S. Nicotinic cholinergic signaling in hippocampal astrocytes involves calcium-induced calcium release from intracellular