EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测.docVIP

　　EMB基因330密码子分子DNA探针设计及荧光检测 作者：陈庆海，府伟灵，刘春江，吴蔚，匡红 【摘要】 目的 针对结核杆菌耐乙胺丁醇embB330密码子位点设计分子DNA探针，尝试运用荧光分光光度计直接观测液相中分子DNA探针与embB330密码子扩增产物杂交后的荧光信号，从而检出该位点突变。方法 运用软件Beacon designer设计embB基因包含330密码子的分子DNA探针，应用荧光分光光度计检测embB306密码子扩增片段与探针杂交后荧光信号，比较扩增产物测序结果。结果 通过荧光分光光度计观测到结核标准株及embB330密码子突变株PCR产物与探针杂交后荧光信号存在显著差异；33株耐乙胺丁醇组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较，耐乙胺丁醇组embB330密码子突变检出率为3%，测序法突变检出率为3%。结论 分子DNA探针技术可以有效检测embB330密码子单碱基靶点突变；应用荧光分光光度计直接观测液相荧光杂交信号简单、灵敏。 【关键词】 耐乙胺丁醇embB基因；330密码子点突变；分子DNA探针；荧光分光光度计 Abstract: Objective To design molecular DNA probe detecting embB330 codon of Ethambutol resistant mycobacterium tuberculosis (MTB)，and to detect fluorescence of mutation site of embB330 codon in liquid by fluorescence spectrophotometer. Methods The softolecular DNA probe detecting embB306 codon and detecting fluorescence signal from hybridization betplified product and probe by fluorescence spectrophotometer，and confer to the sequencing results. Results The difference bet standard strain and Ethambutol resistant one is obvious in detecting the fluorescent light by use of fluorescence microscope. B)耐药的突变基因作了详尽的研究。研究结果表明结核杆菌embB基因306位密码子突变是耐EMB产生的主要原因，其他285、303、330密码子等突变也是引起该类耐药的重要原因［1］。针对广泛存在的单碱基突变位点不易检测，应用分子探针高灵敏直接检测单碱基突变是近年来一个重要技术 发展 。其中具有茎环结构分子DNA探针就是一类根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移(FRET)现象而设计的DNA探针，对单碱基检测具有很高的灵敏性和特异性［2］。本研究选择结核杆菌耐乙胺丁醇一个重要突变位点embB330密码子，设计相应的分子DNA探针，通过扩增及杂交、采用荧光分光光度计观测液相杂交荧光信号，并比较测序结果，为结核杆菌耐药位点准确测定提供一种新手段。 1 材料与方法 1.1 乙胺丁醇耐药菌株、标准株来源及其基因组DNA提取 结核分枝杆菌标准株H37RV(ATCC 27294)来源于 中国 药品生物制品鉴定所，耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株来源于重庆市肺科 医院 （42RE＼A021E＼307E等共33株），金葡菌对照组来源于本科室。按全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌培养(Roch培养基)、菌种鉴定和药敏试验。灭活条件为：85 ℃，1 h。采用QIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，耐乙胺丁醇结核分枝杆菌菌株和标准株DNA提取后，置-20 ℃冰箱中备用。 1.2 主要仪器 　　荧光分光光度计、热循环仪(GeneAmp PCR System 2700型)、碧云天恒温水平摇床、电泳仪、离心机等。 1.3 引物及分子DNA探针设计、合成 　　经查寻 2 结果 分子DNA探针TBembB330密码子MB二级结构预测见图1。 运用荧光分光光度计观测embB330密码子序列扩增-分子DNA探针杂交结果见图2。 结核杆菌耐乙胺丁醇临床分离株PCR扩增产物测序，发现embB330codon位点突变仅1株：305SRE，为TTC→GTC；其余：605E、942ER、987E、153E、A021E、102E、409ER、075ES、292ER、85E、53E、3