北工大微生物学第二章.ppt

第一节 微生物的分离和纯培养 一. 无菌技术 培养物的纯洁 污染 自身/环境 1.微生物培养常用的器具及其灭菌 试管 玻璃烧瓶 培养皿 培养基 第一节 微生物的分离和纯培养 2.接种操作 二、用固体培养基获得纯培养 微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。 最常用的方法有涂布平板法、稀释倒平板法、平板划线法、 稀释摇管法等分离法等。 二、用固体培养基获得纯培养 涂布平板法----将已经熔化的培养基倒入无菌培养皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌涂布棒将菌液均匀的分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落. 涂布平板法: 稀释倒平板法 这是最常用的纯种分离法，先将待分离的材料作一系列的稀释(如1：10、1：100、1：1000、1：10，000……)，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，平皿上就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 平板划线法 将已熔化的培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，用接种环沾取少许待分离的材料，在培养基表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落。划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起。由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落。这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。用其他工具如弯形玻璃代替接种环，在培养基表面涂布，亦可得到同样结果。此法较为简便。 稀释摇管法 先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热,使琼脂熔化后冷却并保持在500C左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡混合物,将培养基和空气隔开.培养后,菌落形成在琼脂柱的中间.进行单菌落的挑取和移植,需要先用一灭菌针将液体石蜡-固体石蜡盖取出,再用一只毛吸管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植. 微生物纯培养分离方法的比较 涂布平板法:简单易行，但易造成机械损伤 稀释平板法 既可定性，又可定量，用途广泛 平板划线法 方法简便，多用于分离细菌 稀释摇管法局限于高度专业化的科学研究  四. 单细胞挑取法分离 这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取，再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。 五. 利用选择培养基分离法 不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境，有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性，便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到纯种分离的目的。另外，也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离机率，往往在涂布分离前先进行富集培养，其目的是提供一个特别设计的培养环境，以帮助所需的特殊生理类型的微生物的生长，而不利于其他类型微生物的生长。 六. 微生物的保藏技术 通过分离纯化得到的微生物纯培养物,必须通过保藏技术使其在一定时间内不死亡,不会被其他微生物污染,不会因发生变异而丢失重要的生物学性状,否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行. 生物的生长一般都需要一定的水分,适宜的温度和合适的营养,微生物也不例外.菌种保藏就是根据菌种的特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续. 例如:培养基或宿主—菌株连续移种 改变环境条件---干燥,低温.缺氧.避光,缺乏营养 使菌株的代谢水平降低,乃至完全停止.—半休眠. 休眠. 六. 微生物的保藏技术 菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。 菌种保藏的原理 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最