不同品种绞股蓝同功酶谱初步研究.docVIP

　　不同品种绞股蓝同功酶谱初步研究 作者：刘金龙 田国政 孙东发 赵玲 【摘要】 目的绞股蓝为名贵药食两用中药，品种多性状相似易混。用同功酶谱从生化水平建立起生产上推广的绞股蓝种质档案，为其新品种选育和提纯复状提供种质鉴别依据。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究绞股蓝的同功酶谱。结果恩五叶蜜，恩七叶甜，绞股蓝，原变种，八叶 自然 株系的酶带数依次为9，9，9，10；酶带颜色依次为4深5浅，2深7浅，3深6浅，2深8浅；酶带宽度依次为6.00～8.56 nm，4.87～6.61 mm，6.01～6.84 mm，4.87～6.61 mm；酶带Rf值依次为0.14～0.90，0.16～0.93，0.14～0.76，0.07～0.89。结论研究发现，它们的同功酶有较大差异，从生化分子水平证明它们是不同的品种，可作为绞股蓝种质鉴别依据。 【关键词】 不同品种绞股蓝； 过氧化氢同功酶 绞股蓝Gynostemma pentapHyllum(Thunb.) makino系葫芦科多年生攀援草质藤本植物，为名贵的药食两用中药。其含有多种皂苷、氨基酸、多糖、微量元素、磷脂和黄酮类等化合物，而且有4种绞股蓝皂苷与人参皂苷的结构相同，有16种绞股蓝皂苷经水解后得到人参皂苷K，被誉为“第二人参”。具有抗疲劳、抗衰老、抗乏氧功效，长期应用能增强人体免疫力，同时有显著的镇静、催眠、抗疲劳、降血脂、保肝护心及 治疗 偏头痛功效，能调整机体的新陈代谢、延长细胞寿命、增强记忆力、增强免疫功能，防止正常细胞癌化，使癌细胞恢复正常，对肝癌、子宫癌、肺癌等癌细胞增殖的抑制有效果，适用于二十多种癌症，绞股蓝皂苷已开发为国家二级新药，是我国发改委认证的高新技术出口产品［1～3］，其多糖在临床上也有重大发现，用其也开发了许多产品。目前我国生产上使用的绞股蓝品种有恩五叶蜜、恩七叶甜绞股蓝、绞股蓝原变种3个品种。为了用生化手段准确鉴别其品种［4，5］和八种叶自然株系，对其进行了过氧化氢酶研究。 1 器材与方法 1.1 材料绞股蓝原变种和“恩五叶蜜”均采于湖北民族学院生物园。“恩七叶甜”、八叶自然株系采于湖北洲恩施州咸丰县武陵生物科技有限责任公司。 1.2 仪器AL-204型 电子 天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHSJ-4A型实验PH计（上海精密 科学 仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL-L6G-A型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；V16-夹心式垂直电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；STS-2型脱色摇床（上海琪特分析仪）；BLD-268RSD冰箱（河南新飞电器有限公司）；DL-1型电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市小阳电子仪器厂）；YZYE-QI移液枪50ul（上海求精生化仪器）；镀铬游标卡尺（武汉教学仪器厂）；微量注射器（100μl）。 1.3 试剂A液（1.5 mol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸 Tris-HCl，pH8.8分离胶缓冲液）：称取18.15 g Tris，用60 ml双蒸水溶解，再用4 mol/L盐酸调节至pH8.8，然后定容至100 ml，4℃保存。 B液（丙烯酰胺凝胶贮备液）：取30 g丙烯酰胺（Arc）和0.8 g双丙烯酰胺（Bis）溶于双蒸水中，并定容至100 ml，待完全溶解后用滤纸过滤，4℃下避光贮存备用，可保存1～2个月。 C液（10%SDS溶液）：称取10 g十二烷基硫酸钠（SDS）溶于80 ml双蒸水中，并轻缓搅拌（室温低时需水浴溶解），再定容至100 ml，室温存放。 D液（10%TEMED）：量取100 μl（N，N，N，N）-四甲基乙二铵（TEMED），加双蒸水定容至1 ml。 E液（10%过硫酸铵）：称取过硫酸铵0.1 g，溶于1 ml双蒸水中，用前配制。 F液（0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8浓缩胶缓冲液）：称取6.06 g Tris，用60 ml双蒸水溶解，再用4mol/L盐酸调节至pH6.8，然后定容至100 ml，4℃保存。 样品缓冲液（样品溶解液）：称取0.303 g三羟甲基氨基甲烷，分别取0.189 ml盐酸，4 ml甘油，0.8 g溴酚蓝，0.2 ml巯基乙醇，0.1%（质量浓度）溴酚蓝0.2 ml，再取双蒸水使之总体积10ml，4℃保存。 电极缓冲液：称取3.0 g三羟甲基氨基甲烷，14.4 g甘氨酸，1.0 g十二烷基硫酸钠，用水溶解后，定容至1000 ml，pH8.3，不必调节。 染色液