第7章分子荧光法.docVIP

第七章 分子荧光分析法 第一节 概述 物质的分子吸收一定的能量后，其电子从基态跃迁到激发态，如果在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光（molecular luminescence），以此建立起来的分析方法，称为分子发光分析法。 物质因吸收光能激发而发光，称为光致发光（根据发光机理和过程的不同又可分为荧光和燐光）；因吸收电能激发而发光，称为电致发光；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光，称为化学发光或生物发光。根据分子受激发光的类型、机理和性质的不同，分子发光分析法通常分为荧光分析法，燐光分析法和化学发光分析法。 荧光分析法历史悠久。早在16世纪西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，就发现含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现出极为可爱的天蓝色，但未能解释这种荧光现象。直到1852年Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到它们能发射比入射光波长稍长的光，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射的不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念，并根据荧石发荧光的性质提出“荧光”这一术语，他还论述了Stokes位移定律和荧光猝灭现象。到19世纪末，人们已经知道了包括荧光素、曙红、多环芳烃等600多种荧光化合物。近十几年来，由于激光、微处理机和电子学新成就等科学科术的引入，大大推动了荧光分析理论的进步，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的发展，加速了各种新型荧光分析仪器的问世，进一步提高了分析方法的灵敏度、准确度和选择性，解决了生产和科研中的不少难题。 目前，分子发光分析法在生物化学，分子生物学，免疫学，环境科学以及农牧产品分析，卫生检验、工农业生产和科学研究等领域得到了广泛的应用。 第二节 分子荧光分析法的基本原理 一、荧光（燐光）光谱的产生 物质受光照射时，光子的能量在一定条件下被物质的基态分子所吸收，分子中的价电子发生能级跃迁而处于电子激发态，在光致激发和去激发光过程中，分子中的价电子可以处于不同的自旋状态，通常用电子自旋状态的多重性来描述。一个所有电子自旋都配对的分子的电子态，称为单重态，用“S”表示；分子中的电子对的电子自旋平行的电子态，称为三重态，用“T”表示。 电子自旋状态的多重态用2S+1表示，S是分子中电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对时，即S=0，多重态2S+1=1，该分子体系便处于单重态。大多数有机物分子的基态是处于单重态的，该状态用“S0”表示。倘若分子吸收能量后，电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋平行（不配对）的电子，即S=1，多重态2S+1=3，该分子体系便处于激态三重态。符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。 处于激发态的分子是不稳定的，它可能通过辐射跃迁和无辐射跃迁等分子内的去活化过程丧失多余的能量而返回基态。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，伴随着荧光或燐光现象；无辐射跃迁的去活化过程是以热的形式辐射其多余的能量，包括内转化（ic），系间窜跃（isc）、振动弛豫（VR）及外部转移（ec）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的物理和化学环境等因素有关。 假设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1和λ2的辐射光之后，分别激发至第二激发单重态S2及第一激发单重态S1，图9-1示意了分子内所发生的各种光物理过程。 振动弛豫 它是指在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式放出。发生振动弛豫的时间为10－12S数量级。图9-1中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况。 内转移 当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移到低能级。图9—1所示，处于高激发单重态的电子，通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。 荧光发射 处于第一激发单重态最低振动能级的电子跃回至基态各振动能级时，所产生的光辐射称为荧光发射，将得到最大波长为λ3的荧光。注意基态中也有振动弛豫跃迁。很明显，λ3的波长较激发波长λ1或λ2都长，而且不论电子开始被激发至什么高能级，最终将只发射出波长λ3的荧光。荧光的产生在10－6～10－9S内完成。 系间窜跃 指不同多重态间的无辐射跃迁。如：S1→T1。通常，发生系间窜跃时，电子由S1的较低振动能级转移到