二黄糖肾康对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及PI3 K-AKT信号转导系统的影响.docVIP

　　二黄糖肾康对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及PI3 K/AKT信号转导系统的影响 作者：常庚 成秀梅 潘莉 梁文杰　张金虎　常风云 【摘要】 目的 观察二黄糖肾康对糖尿病肾病(DN)大鼠细胞凋亡及PI3 K/AKT信号转导系统的影响。 方法 SD大鼠单侧肾切除加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制DN模型，每日二黄糖肾康灌胃，8 . Methods DN model rats ade by streptozotocin (STZ) lumbar injection and unilateral nephrectomy etry. The expression of phosphorylation Akt protEin easured by ber of apoptosis cell in DN rat′s renal cortex, reduce the expressions of Bax, Fas and FasL, increase the expression of Bcl2 and activate PI3 K/AKT signal pathl口服液，备用。贝那普利，10 mg/片，北京诺华有限公司生产。格列喹酮(糖适平，30 mg/片)，北京万辉双鹤药业有限责任公司生产。STZ购自美国Sigma公司。羊抗鼠FITCIgG为Santa Cruz产品。磷酸化和非磷酸化、AKT均购自 Cell Signal公司。 　　1.3 模型建立 大鼠适应性喂养1 l/100 g，常规备皮消毒，腹部切口，长约1.5 cm，逐层剪开皮肤、肌肉、筋膜，暴露右肾，剥离肾包膜，止血钳夹住肾动脉、输尿管，并结扎。剪下右肾，关闭腹腔，分层缝合腹膜、肌肉、皮肤，并于伤口处滴0.01 ml庆大霉素，预防术后伤口感染。2 g/kg腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mol/L，pH4.5的枸椽酸钠缓冲液中)。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。48 h后尾尖取血，测定血糖，血糖≥16.7 mmol/L为成模。 　　1.4 动物分组及给药 随机抽取10只大鼠为假手术组。假手术组暴露右侧肾脏后再放回腹腔，关闭腹腔，分层缝合。其余50只按照上述方法制备模型，共45只大鼠成模。取40只成模的大鼠，按照空腹血糖的层次，随机分为模型组、二黄糖肾康低剂量治疗组、二黄糖肾康高剂量治疗组、贝那普利治疗组，加假手术组共五组，每组10只。二黄糖肾康低剂量治疗组、二黄糖肾康高剂量治疗组和贝那普利治疗组均于上午给予糖适平5 mg/kg体重，用1 ml蒸馏水溶解，灌胃。下午贝那普利治疗组给予贝那普利1.7 mg/kg体重，用1 ml蒸馏水溶解，灌胃;二黄糖肾康低剂量治疗组给予二黄糖肾康口服液0.5 ml/100 g体重(相当于成人的10倍)，灌胃;二黄糖肾康高剂量治疗组给予二黄糖肾康1 ml/100 g体重(相当于成人的20倍)，灌胃。本实验共8 g，冰浴,加入500 μl组织裂解液,冰浴匀浆,4 ℃,12 000 r/min离心10 min，收集上清,应用BCA 蛋白定量试剂盒(Pierce，UK) 进行蛋白定量。其余样品用4×上样缓冲液稀释,封闭后100 ℃水浴10 min，-70 ℃保存。以每个样品的总蛋白为20 μg上样,进行SDSPAGE凝胶电泳(浓缩胶为8%,分离胶为12%)，转膜至PVDF(Invitrogen)，脱脂奶粉封闭,一抗封闭4℃过夜,二抗37℃孵育1 h (羊抗兔)，漂洗后用增强化学发光法检测蛋白表达,自动扫描,进行灰度分析。 　　1.8 统计分析 采用Excel软件及SPSS10.0统计软件进行统计分析，组间比较用方差分析，数据用x±s表示。 　　 2 结 果 　　2.1 流式细胞术检测肾脏细胞凋亡数目 模型组(13.98±1.74)细胞凋亡率与假手术组(4.17±0.77)相比明显升高(Plt;0.01);贝那普利组(7.58±1.08)、二黄糖肾康低剂量组(6.34±0.95)、二黄糖肾康高剂量组(5.24±0.44)与模型组相比明显降低(Plt;0.01)，二黄糖肾康高剂量组与贝那普利组比较有显著差异(Plt;0.05)。 　　2.2 流式细胞术检测Bax、Bcl2及Fas、FasL蛋白表达 与模型组比较发现二黄糖肾康低、高剂量组能明显升高Bcl2降低Bax、Fas、FasL表达(Plt;0.01，Plt;0.05);贝那普利组与模型组比较各项蛋白表达有差异(Plt;0.05);在Fas、FasL蛋白表达方面，二黄糖肾康低、高剂量组间比较有明显差异(Plt;0.01)，二黄糖肾康低剂量组较贝那普利组有所降低(Plt;0.05)。见表1。 　　2.3 各组Akt、pAkt信号蛋白的表达