洋葱内表皮细胞微丝.pdfVIP

实验 考马斯亮蓝R250显示洋葱内表皮 细胞微丝 真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构称 为细胞骨架(cytoskeleton)， ●细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维 网架体系 有狭义和广义两种概念 ◆在细胞质基质中包括微丝、微管和中间纤 维。 ◆在细胞核中存在核骨架-核纤层体系。核骨 架、核纤层与中间纤维在结构上相互连接, 贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。 微丝(microfilament, MF) 又称肌动蛋白纤维(actin filament), 是指真 核细胞中由肌动蛋白(actin)组成、直径为 7nm的骨架纤维。又名肌动蛋白丝，其长度不 定，多分布在近细胞膜的下方。微丝是肌动蛋 白亚单位组成的螺旋状纤维（F-actin），在不 同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起 形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stress fiber ）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。 观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细 胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250 （coomassie brilliant blue R250 ）显示微 丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细 胞中普遍存在，与细胞对基质的附着、维持 细胞扁平铺展的形状有关； 实验目的 1. 掌握考马斯亮蓝R250染动植物细胞胞质微 丝的方法。 2. 对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。 实验原理 考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使 各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，细胞 内有些细胞骨架纤维在本实验条件下不够稳定，例如微 管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分 辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径 约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常能贯穿细胞 全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学 等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微 丝组成的张力纤维的实验方法。 染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲 剂，EGTA和EDTA螯合Ca 2+ 离子，溶液 中并提供Mg 2+ 离子，在此低钙条件下， 骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。 实验用品 一、材料 洋葱内表皮 二、试剂 1. 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法 0.2mol/L Na HPO /KH PO 缓冲液 2 4 2 4 (pH7.3) 50 ml NaCl 0.15 mol/L 重蒸馏水至 1000 ml 其中PB的配法: 0.2 mo1/L Na2HPO4 77 ml 0.2 mo1/L NaH2PO4 23 ml 2. M-缓冲液 咪唑(imidazole, pH6.7) 50 mmol/L KC1 50 mmol/L MgCl2 0.5 mmol/L EGTA l mmol/L EDTA 0.l mmol/L 巯基乙醇(mercaptoethanol) l mmol/L 甘油