ARMS-PCR剖析.pptx

ARMS-PCR法 目录 ARMS技术 ARMS法与测序法比较 实时荧光定量PCR原理 ARMS技术 目前，突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）已成为国际上肿瘤个体化分子检测最重要、最先进的技术之一，其在临床应用中的优势已被业内专家广泛认可。 ARMS技术 等位基因特异性扩增法（Allele-specific amplification,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统（amplification refractory mutation system, ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR, ASPCR）等，用于对已知突变基因进行检测。 该法通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3’端引物进行两个平行PCR，需有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3’端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。 ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。 ARMS技术优点 ARMS方法检测灵敏度明显高于直接测序法等其他方法（表1），可检测出样品中含量低至0.1~1.0%的突变基因；该方法在设计上可以最大限度地缩短目标产物的长度，可以解决石蜡包埋组织标本提取的DNA大部分片段化而无法得到准确检测结果的难点；该方法结合实时PCR平台实现闭管操作，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度地避免扩增产物的污染。 ARMS法与测序法比较 测序法 ARMS法 敏感度 10~20% 1% FFPE标本成功率 低 高 商用试剂盒 无 有 流程与速度 复杂\慢 简单\快 数据分析要求 高 低 试剂成本 低 略高 仪器成本 高 低 假阳性机会（交叉污染） 多 少 实时荧光定量PCR ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测，以达到对基因突变检测的高特异性和高灵敏度。 实时荧光定量PCR 该技术的基本原理是利用Taq酶的5’外切酶活性，当引物延伸至被荧光探针结合的模板处，Taq酶即从5’ →3’方向降解并释放荧光探针5’端的核苷酸。 由于探针的两端均有一个荧光分子标记，其中3’端的荧光分子（荧光淬灭基团）能够吸收5’端荧光分子（荧光报告基团）的荧光信号，当探针完整时，报告基团发射的荧光信号正好被淬灭基团接收，因此就检测不到荧光信号； 当Taq酶将探针5’端带有荧光报告基团的核苷酸降解下来时，破坏了两荧光分子间的荧光共振能量转移（FRET），从而发出荧光，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光分子数与PCR数量成比例，从而实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。TaqMan荧光探针常用报告基团有FAM、TET、VIC和HEX，淬灭基团有TAMRA。 ——TaqMan技术 ARMS-PCR基本原理 操作流程及数据解读 DNA ARMS-PCR 数据分析 谢谢！