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Western转印的优化小技巧 从SDS凝胶中进行Western蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行高效转印需要一定程度的优化，尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。 转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时使用第二个支持膜，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差，可以考虑下列因素： SDS vs 酒精 在多数转印实验步骤中都使用SDS和酒精。但两者对于成功的转印有相反的作用，需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。 SDS对于蛋白的迁移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用，SDS过多会抑制结合，尤其对于硝酸纤维素膜。如果从蛋白上剥离太多SDS，将无法将蛋白转移出膜。作为一个一般性的规则，如果膜的结合力有效，但蛋白仍旧残留在凝胶上，在转印缓冲液中加入0.01％会促进完全转印。建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS，但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的SDS对于有效的转印已经足够。但另一方面，酒精通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。一般在转印缓冲液中加入20％的甲醇会增加硝酸纤维素膜的接合能力。 凝胶浓度 丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度最低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。 凝胶厚度 蛋白比较易于从薄胶上转移下来，所以上样体积允许，使用1.0mm厚的胶取代1.5mm的胶。 电场（电压×时间） 如果电压过低而且转印时间过短，部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高，小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上，增加电压可能会有帮助，但不要超过5V。但注意，一旦SDS从蛋白剥离，增加转印时间或提高电压就无效果。一旦结合，即使延长转印时间，大部分蛋白也会保持在膜上。 膜的类型 结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对于小的多肽，建议使用小口径的膜。 PVDF比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白测序。 尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更严谨的封闭条件。主要建议用于Northern和Southern。 转印两块凝胶 1. 重复步骤1-6 两次，制作两个凝胶-膜组装体。 2. 将两个预浸泡过的转印垫放在转印模块的阴极外壳上。将第一个凝胶-膜组装体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近。 3. 将另一块预浸泡过的转印垫放在第一块膜复合体上。 4. 将第二个凝胶-膜组装体按正确的方向放在转印垫上，使凝胶离阴极板最近。 5. 进行转印一块凝胶中的8-13步。 在WB过程中从SDS胶上转移蛋白至膜上是非常关键的步骤！优化转移时间往往需要实验多次，下面就讲几条关于如何保证蛋白完全转移的小技巧，适合新手参考: 使用预染的marker? 预染marker不仅能够直观的观察到跑胶情况，而且在转移过程中也是很好的工具，在完成印迹后观察膜上的? marker ，看是否所有条带都已经转移至膜上。 在转印装置中加两块膜 小分子量的蛋白转移的比较快，而为保证大分子蛋白的转印，长时间的转印可能使小分子担保透过膜，因此，加入两块膜是个明智的选择，如果能在第二块膜上检测到小分子蛋白，说明转印时间过长。 在转印后对胶染色? 如果转印时间不够的化，通过对胶染色，在胶上能够观察到未转移完全的蛋白，这种情况在转印大分子蛋白是常见，使用银染或者考马斯亮蓝的方法都可以。