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分子综合性实验论文终稿任佳
编号 类型 成绩
生物学综合实验
Comprehensive Experiment of Biology
论文题目 Pfu酶的表达，纯化及功能分析
作者姓名 学号 2010114010117 所在院系 生命科学学院 专业名称 生物科学 王友如 时间 201年月日
关键词： pfu DNA 聚合酶；IPTG诱导；纯化；活性。
Expression ,purification and function
research of pfu DNA polymerase
Ren Jia
Tutor: Wang Youru
(College of Life Science , Hubei Normal University,Huangshi,Hubei Province ))
Abstact: Aim：Express pfu DNA polymerase in E. Coli DH5α，then purify it and research its function .Method: E. Coli DH5α containing pfu DNA polymerases gene ,10-12h after 1mM IPTG addition ,were wall-broken by ultrasonic wave. The extraction were purified by heat treatment (80℃，30min to denature E. Coli proteins), followed by metal-affinity chromatography on Ni2+-Sepharose columns. Conclude: We got pfu DNA polymerase after purification, then found that the enzymes were characterized and displayed high DNA polymerase activity. We use it successfully in amplification of VHB gene.
Keywords：Pfu DNA polymerases； IPTG addition；Purification；Activity.
Pfu DNA聚合酶是从超高温古生菌强烈炽热球菌 ( Pyrococcus furiosus)中分离得到的，拥有 3′→5′外切酶活性 ,这使它在 PCR扩增过程中能够校正错误 ,是已知 DNA聚合酶中出错率最低的 ,特别适用于需要高保真度的 PCR扩增[1]，被认为有潜力取代目前广泛使用的Taq酶。Pyrococcus fuiosus最早是在意大利Vulcano地热海底沉淀物中发现的。Pfu DNA聚合酶基因编码一个775个氨基酸的多肽 ,分子量 90 ,109D。这种酶最初是直接从 Pyrococcus fuiosus中分离得到的,但因这种极端嗜热的厌氧菌很难培养,难以获取大量的酶。本项目通过修饰引物使Pfu基因末端引入His-tag编码序列，从已有Pfu基因的载体上把它克隆下来，重新连接入更易表达的pET-28a载体中，并在大肠杆菌DH5α中大量表达，通过纯化使其与商用Pfu酶活性相当并对其功能做具体研究，发现其具有较高的活性。
目 录
1.前言 1
2 材料与方法 2
2.1 材料 2
2.1.1 实验材料 2
2.1.2 仪器设备 2
2.1.3 试剂及溶液 3
2.2 方法 7
2.2.1 Pfu酶的表达…………………………………………………….7
2.2.2 目的蛋白的纯化 10
3 结果与分析 13
3.1 SDS电泳结果分析 14
3.2 PCR结果分析 14
4 讨论 16…………………………………………………………………………..16
5.1 纯化过程中可能出现的问题…………………………………………1.2 PCR过程中可能出现的问题 1 参考文献 1致谢 18
Pfu酶的表达，纯化及其功能分析
任佳
指导老师：王友如
（湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石 435002）
1.前言.
Pfu最初是直接从Pyrococcusfuriosus中提取出来的[2] [3]，但是这种嗜热性厌氧菌很难生长到一定的规模而获得大量这种蛋白质酶，所以在杆菌中表达重组的Pfu酶是一个较好的选择。Lu和Erickson[3]利用pET载体，成功的在大肠杆菌中表达出Pfu酶，并且可以轻易的进行毫克量的生产。Dabrowski[4]在酶的末端加上一
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