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Western blot for PAR-2 一、 试剂的配制 1. PMSF(100 mM)的配制: 0.1742 g PMSF → 10 ml异丙醇（－20℃保存））2X Sample Buffer(要用才配或配好后置于-80℃) 1倍DTT加上9倍的2X Laemmli Buffer (1). DTT (Di-dithiothreitol) 1M 1.542 g DTT → 10 ml的10 mM Sodium acetate(醋酸钠)（ pH=5.2）中 10 mM Sodium acetate(醋酸钠)：0.082 g 无水醋酸钠 → 100 ml dH2O (2). 2X Laemmli Buffer (100 ml) (置于－20°C，经常使用时置于4°C) Glycerol （甘油） 20 ml β-mercaptoethanol （β-me，β-巯基乙醇） 5 ml （恶臭，注意安全） 20﹪SDS （十二烷基硫酸钠） 10 ml Bromophenol Blue（溴酚蓝） 20 mg 1.5M Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷）pH=6.8 20 ml (90.855 g Tris→420 ml dH2O, 浓盐酸滴定至pH=6.8，定容至500 ml ) dH2O 45 ml 4. 30％ A+B溶液 29．2 g Acrilamide (丙烯酰胺) 0．8 g Bis－acrilamide (甲叉双丙烯酰胺) Add dH2O dilute to 100 mL and filter 避光4°C储存 注意：该两种药品有毒，配药时注意安全PS. Acrylamide 及Bisacrylamide 是neurotoxin会穿过皮肤，配药时要穿实验衣及戴口罩。 （30﹪ Acrylamide 1﹪ Bisacrylamide） 5．1.5M tris? (500ml )?? ：加入90.855g tris 用HCL调PH 6．AP?: 0.1g/ml 7. 10% SDS的配制： 10 g SDS粉末→100 ml 超纯水，68℃水浴振荡助溶。室温保存 8. 10X SDSRunning Buffer (1L): Dilute 1x tris Base[121.14] 30.3 g Glycin [75.07] 144.1 g SDS 10 g 9． 1X TTBS Buffer（washing buffer，除了blocking后用不含1%奶粉的TTBS冲洗，稀释抗体用含有1%脱脂奶粉TTBS稀释，每次冲洗时用含有1%奶粉的TTBS冲洗？） (1 L for 4片膜) （Tris Buffer Saline with Tween-20） 10X TBS 100 ml Tween-20 1 mL (Tween-20的终浓度为0.1%) 粘稠 枪头剪掉尖端吸取 加入蒸馏水约900 mL定容至1 L。 现用现泡，并置于4°C储存 10X TBS Buffer (Tris buffer saline)(1 liter) 冷藏4°C储存 Tris Base [121.14] 500mM 60.5 g Sodium Cloride (NaCl) 1.5 M 87.6 g Add dH2O dilute to 1L pH= 7.5（以HCl滴定pH） PS.冷藏4°C储存 10. Blocking Buffer (150 mL for 4片膜) [1X TTBS Buffer+ 5% milk (v/w)] (50ml+2.5gmilk) 10X TBS 15 ml Tween-20 150 ul (Tween-20的终浓度为0.1%) 脱脂牛奶 7.5 g （牛奶的终浓度为5