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流式细胞技术原理及其在临床科研中的应用（Flow Cytometry, FCM) 北京利文商贸有限责任公司 李建廷 主要内容 流式细胞技术概念 流式细胞技术原理 流式实验的设计 流式细胞技术在临床科研上的应用 流式细胞技术概述 什么是 FCM ？ 流式细胞术：利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析及分选的技术 激光技术+流体力学+光电测量技术+计算机技术+细胞荧光化学技术+单克隆抗体技术 FCM的特点 测量速度快：最快可在1秒种内检测上万个细胞 可进行多参数测量：可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量 具有明显的统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况 高分辨率(CV2%)、高灵敏度(荧光检测灵敏度≤100MESF，前向角散射光检测灵敏度(0.2～0.5um) 既是细胞分析技术，又是精确的分选技术，分选纯度可达99%以上 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 BD公司流式细胞仪 流式细胞仪的结构 光路： 1、激光光源及光束成形系统： 氩离子(488nm) 红色氦氖激光(633nm) 2、光学系统：透镜、滤光片、小孔 液路——流动室及液流驱动系统（鞘流原理） 信号检测与分析：光电倍增管(PMT)、补偿电路 存储、显示、分析系统：计算机 细胞分选系统 流式细胞技术原理 荧光及荧光发生机理简介 荧光及荧光素： 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线 ——即荧光。受激发后能产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 荧光发生机理： 室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子不稳定，它可以通过在10-9～10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。 荧光素的激发和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱 激发光谱（Excitation，Ex）： 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。 吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max 发射光谱（Emission，Em）： 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光 发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 荧光素的使用： 选择正确的激光器 确定所需荧光探测器（PMT） 荧光光谱示意图 散射光信号 散射光信号 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 流式细胞仪的荧光检测信号 荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 数据分析 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等 数据分析 数据分析 数据分析 等高图和密度图分析 数据分析 三维图分析 流式实验设计原则 常用的单克隆抗体荧光标记探针 488nm激光激发： FITC（异硫氰酸荧光素）： 荧光强度可受pH的影响，当pH降低时其荧光强度也随之减弱 PE（藻红蛋白） PerCP（多甲藻叶绿素蛋白）：光量子产量并不太高，最好应用在检测表达较高的抗原上 PerCP-Cy5.5（叶绿素蛋白偶联物） PE-Cy7（藻红蛋白偶联物） PE-Cy5（藻红蛋白偶联物，又称Cy-Chrome） PE-Texas Red（藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECD） 633nm激光激发： APC（别藻青蛋白） APC-Cy7（别藻青蛋白偶联物） 常用的核酸荧光标记探针 PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中，主要用于对DNA染色，使用时需用RNase对细胞进行处理；不能透过活细胞膜对核酸染色，可用于鉴别活死细胞，对活细胞染色时需对细胞膜打孔，以便染料透过。488nm激光激发，发射光谱宽泛550～725nm，可与PE共用通道 TO（噻唑橙）：可用于对网织红细胞中的RNA进行检测定量分析，TO的荧光强度与RNA含量由良好的线性关系，对细胞膜的通透性好，可直接对活细胞染色，488nm激发，可发射出530nm荧光，可与FITC共用通道 常用荧光素激发、发射、光源波长以及适用机型 FACSCalibur光学滤片 F