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3 质粒的复制类型 质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 碱变性法基本原理 （1） 溶菌酶 （2） 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 （3） 中和： pH 4.8 醋酸钠 （三）质粒载体的构建与类型 2.碱变性法（重点掌握） 原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性PH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA 溶菌，释放DNA 蛋白质、DNA变性 中和、质粒DNA复性 1、细胞收集：取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 1.5mL EP管 小型离心机 2、细胞裂解：加入100微升冰冷的细胞裂解液液，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，4-5mg溶菌酶）静置5分钟； 加样枪 3、染色体变性：加入200微升微冷的碱液（0.2NaOH，1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟（65度水浴一段时间会加强染色体DNA的变性作用）。 4、复性：加入150毫升冰冷的PH=4.8的3M醋酸钠，振荡后，冰浴5分钟。 5、质粒DNA的获得：离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒DNA。 小型离心机 冰浴盒 质粒抽提试剂盒操作流程： ①大肠杆菌的培养：从平板上挑选单菌落接种至2 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37 ℃过夜培养； 菌落培养 加样枪 细菌培养管 液体培养基 台式恒温培养摇床 取2 ml的过夜培养菌液，12，000 rpm 离心2 min, 弃上清。 小型离心机 ②用250 ul 的SolutionⅠ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀 ③加入250 ul 的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。 ④加入400 ul的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻地上下翻转混合5-6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2 min。 ⑤室温12，000rpm离心5分钟，取上清。 ⑥将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。 将上述操作的上清液转移至Spin Column中，3，600rpm离心1min（如Spin Column中有液体残留，可适当提高离心速度，再离心1min），弃滤液。 ⑦将500ul的Rinse A加入SpinColumn中，3，600rpm离心30s，弃滤液。 ⑧将700ul的Rinse B加入Spin Column中，3，600rpm离心30s，弃滤液。 ⑨将700ul的Rinse B加入Spin Column中，然后12，000rpm再离心1 min。 ⑩将Spin Column 安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入60ul的水或洗脱液，室温静置1 min。 12，000rpm离心1 min洗脱DNA，-20?C保存 3.影响质粒DNA产量的因素： （1）寄主菌株的遗传背景 大肠杆菌寄主菌株的正确选择，是获得高产量质粒DNA的重要条件之下。为此一般建议使用endA基因发生突变的（endA1）大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。 EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。 3.影响质粒DNA产量的因素： （2）质粒的拷贝数及分子大小　　质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下降。 * 按来源分 （1）质粒（Plasmid）：是细胞染色体或核区DNA外能够自主复制的很小的环状DNA分子，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 大肠杆菌质粒 （2）M13单链噬菌体 　　M13是一种线状、单链DNA噬菌体，总长6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌体首先吸附大