2016-2017学年度人教版选修1血红蛋白的提取和分离课件（24张）.ppt

教学目标 教学重点 教学难点 理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理 了解缓冲液的组成及其作用 血红蛋白的分离－－样品处理 凝胶色谱法的原理 电泳法分离大分子的原理 一、基础知识 （一）凝胶色谱法（分配色谱法） 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 凝胶是一些微小的多孔球体，由多糖类化合物（如葡聚糖、琼脂糖等）构成。 凝胶粒 分离生物大分子的基本思路： 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 分子量 大 小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面 小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部 运动方式 垂直向下移动 垂直向下移动，无规则扩散进入颗粒内部 运动速度 较快 较慢 运动路径 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱洗脱出来 后从凝胶柱洗脱出来 凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示 凝胶色谱法（分配色谱法） 凝胶： 是由多糖类化合物分子（如葡聚糖或琼脂糖）在一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体（凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。 凝胶色谱法（分配色谱法） 凝胶色谱法的原理 ①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 凝胶色谱柱 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。 凝胶电泳法 电泳 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。 血液 血浆 水 分 其他物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 2. 血液有哪些成分？ 1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 二、实验操作 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 1.样品处理： （一）蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化。 ②洗涤操作： 1、采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血液凝固。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液： ①过程：将搅拌好混合液转移到离心管 内，以2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次： 第1层：甲苯层无色透明； 第2层：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体） 第3层：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体） 第4层：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 二、实验操作 (2)血红蛋白的释放： 2、血红蛋白的粗分离----透析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 实验操作 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。 透析过程动画演示 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之