可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究.docVIP

　　可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究 作者：王燕燕，宋兴福，崔向军，黄骥 【摘要】 目的 研究 青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cystEine containing aspartate9,caspase9)和caspase3活性的 影响 。 方法 Art处理A549细胞，流式细胞计数(Floetry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡，比色法检测caspase9活性，g/L Art作用24h，出现S期细胞减少(Plt;0.01)，G2/M期细胞数目增多(Plt;0.01)，细胞凋亡率增加(Plt;0.0)。不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art作用A549细胞24h，caspase9活性呈浓度依赖性增加，分别为对照组的9.87倍、23.33倍（Plt;0.01）、38.47倍（Plt;0.01）和60.47倍（Plt;0.01）。ethodsA549 cells etry. Activation of caspase9 etric assay. Change of caspase3 ent, marked cell accumulation in G2/M phase g/L Art exposure for 24h. In addition, the percentage of apoptosis increased, from (3.5±0.7)% in control cultures to approximately （19.4±1.5）% after 100mg/L Art treated for 24h. caspase9 colorimetric assay shoent, caspase9 activity increased in a dosedependent manner. After A549 cells treated g/L Art for 6h, 12h and 24h, the activity of caspase3 increased edium 1640）和胰蛋白酶，Gibco公司；胎牛血清（Fetal calf serum,FCS），杭州四季青公司；碘化丙啶（PI）,Sigma公司；caspase9 colorimetric assay kit，Calbiochem公司；ECL kit，Kirkegaard Perry Laboratories公司；兔多克隆抗caspase3抗体（H277,sc7148,可识别caspase3酶原和p11、p17、p20 caspase3）和βactin(C2,sc8432)均为Santa Cruz产品；丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、SDS、Triscl、牛血清白蛋白（BSA）、硝酸纤维素膜（NC膜）、考马斯亮兰R250、过硫酸胺（AP）均为Amersco产品。酶标仪(GENios VA200)，奥地利TECAN公司；流式细胞仪（EPICS ALTRA II），美国Beckman公司；凝胶成像系统(BioID)，法国VL公司。 　　1.2细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学 中国 典藏物保存中心，接种于含10% FCS的RPMI1640培养液中，置37℃、5% CO2孵箱中常规培养，每2～3d传代1次。 　　1.3流式细胞计数（Floetry, FCM）检测细胞周期和凋亡100mg/L Art处理细胞，24h后收集细胞，用冷PBS（0.01M pH 7.4）漂洗，滴加80%乙醇-20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min，冰上2min，PI综合染液（含100mg/L PI、0.1% TritonX100）暗处孵育30min。上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。细胞周期统计及凋亡 分析 采用数据获取软件CELLQuest及DNA分析软件ModFit LT。 　　1.4检测caspase9活性A549细胞分别暴露于不同浓度（10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L）的Art，24h后采用比色法检测细胞浆中caspase9活性。检测方法参照caspase9 colorimetric assay kit说明书，简述如下：先采用终浓度分别为0、50、100、200和400mg/L标准物的吸光度绘制标准曲线。收集5×106细胞，加入50μl预冷的细胞裂解液，冰上孵育10min，4℃、10000×g离心1min，收集上清液为细胞抽提物， 计算 蛋白浓度。96孔板中加入用缓冲液稀释的蛋白样本50μl、2×反应缓冲液（含10mM DTT）50μl、4