山羊PRNP基因启动子转录活性研究.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(10):1990-1997 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.10.014 山羊PRNP基因启动子转录活性研究 周荣艳，魏彦辉，锡建中，李兰会，陈 辉，高立杰，张振红 （河北农业大学动物科技学院，河北保定 071001 ） 摘要：【目的】分析山羊PRNP 基因启动子活性区域，旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子， 为阐明山羊 PRNP 基因的表达调控提供理论依据，并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路；【方法】以山 羊 PRNP 基因序列（GenBank 登录号：EU870890）为模板，设计特异性引物，扩增山羊 PRNP 基因 5′侧翼区片段， 并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体，鉴定为阳性的克隆进行测序；利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区 域和转录因子结合位点的预测；利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段 11 个，并克隆至 pEASY-T3 载体 后，鉴定为阳性的质粒和 pGL3-Basic 载体分别用限制性内切酶 Mlu I 和 Bgl II 进行酶切，并回收酶切产物；利 用 T4 连接酶进行目的片段与 pGL3-Basic 连接，鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序，并提取无内 毒素质粒，用脂质体转染法瞬时转染至 SH-SY5Y 细胞，转染 48h 后，利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变 重组质粒在细胞内的启动活性检测；【结果】成功克隆了山羊PRNP基因 5′侧翼区片段，长度为2 332 bp，且该片 段含有预测的启动子活性区域、保守的 motifs 和多个转录因子的结合位点；成功克隆了 11 个含有不同长度启动 子的片段，并与荧光素酶报告基因连接，并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒；转染时脂质体与DNA 的比例为1 ﹕0.5，萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50 ﹕1；山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子， 启动子活性最强的区域为-519—+82 bp，且在-220—+59 bp这一区域存在着正调控元件，外显子1对启动子活性 中起重要的调控作用；4个motifs可能为正调控元件结合位点；在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点，2个 AP-2 alpha结合位点和1个AP-1 结合位点；山羊PRNP基因 motif 3和 motif 4分别预测为转录因子 Foxp3和COE 1 的结合位点。【结论】确定了山羊 PRNP 基因启动子的核心区域（-519—+82bp），外显子 1 对启动子活性起重要 的调控作用。 关键词：山羊；PRNP基因；启动子；转录活性 Transcriptional Activity of Goat PRNP Gene Promoter ZHOU Rong-yan, WEI Yan-hui, XI Jian-zhong, LI Lan-hui, CHEN Hui, GAO Li-jie, ZHANG Zhen-hong （College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, Heibei ） Abstract: 【Objective 】In order to screen the critical region or transcription factors regulating the expression level of prion in goat, the active region in the promoter of PRNP gene was analyzed. These results will provide a theoretical reference for elucidating the regulation of expression and thought for reducing the infe