CCK-8操-作说明与检测步骤.doc

DOJINDO操作说明 细胞活性检测 1.?在96?孔板中接种细胞悬液?(100 ml /孔?)?。将培养板放在培养箱预培养?(在37?℃，5% CO2的条件下?)。 2.?向每孔加入10 ml?的CCK- 8溶液?(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响?O.D值的读数)?。 3.?将培养板在培养箱内孵育?1-4小时。 4.?用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 5.?如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入?10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS?溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在?24小时内吸光度不会发生变化。 细胞增殖?-毒性检测 1.?在96?孔板中配制?100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养?24小时?(?在37℃，?5% CO2的条件下?)。 2.?向培养板加入10 ml不同浓度的待测物质。 3.?将培养板在培养箱孵育一段适当的时间?(例如: 6,12, 24?或48小时?)。 4.?向每孔加入10 ml CCK-8?溶液?(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响?O.D值的读数)?。 5.?将培养板在培养箱内孵育?1-4小时。 6.?用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。 7.?如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入?10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS?溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在?24小时内吸光度不会发生变化。 注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加?CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 制作标准曲线 1.?先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。 2.?按比例?(?例如：1/2比例?)?依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做?3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。 3.?接种后培养2-4?小时使细胞贴壁，然后加?CCK-8试剂培养一定时间后测定?O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标?(X轴)?，O.D值为纵坐标?(Y轴)?的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量?(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入?CCK-8后的培养时间)。 DOJINDO检测步骤 CCK-8 检测步骤 1. 向各孔中加入100 μl细胞悬液。a) 2. 在37℃下预孵育培养板。b) 3. 向各孔中加入各浓度的待测溶液c)10 μl。 4. 37℃下孵育。 5. 向各孔中加入10 μl的CCK-8溶液d)。 6. 37℃下孵育1-4小时。e) 7. 测定450 nm处的OD值。 a) 使用适当的培养基制备50,000-100,000个/ml的细胞悬液。 b) 建议使用CO2培养箱过夜预培养。 c) 使用培养基或PBS来制备溶液。 d) 如果待测溶液有还原性，测定不含细胞，但含有CCK-8的待测溶液在450 nm处的空白吸光度。如果该吸光度很小，则可以直接加入CCK-8 ，如果吸光度相对较大，则需要除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的100 μl培养基和10 μl CCK-8进行检测。 e) 白细胞可能需要培养较长时间。 活力计算 细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100 A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度 A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度 A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力 问答： 1.一个孔中应接种多少个细胞？当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。2.能否用384孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液，如果加入的CCK-8体积太少，可以先将CCK-8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%的量。3.能否用24孔板进行试验？可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK-8溶液。4.酚红会影响检测吗？不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。5.CCK-8与胸苷结合检测之间是否有相关性？有。然而，请注意由于CCK-8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因此结果可能不同。6.CCK-8能否检测细菌细胞