文章名（标题1，2号宋体，居中）-中国中药杂志.doc

川楝子肝毒性成分的筛查研究 赵筱萍1，3*，葛志伟2，张玉峰2，兰小红3，张伯礼1 （1. 天津中医药大学，天津 300193； 2. 浙江大学药学院，浙江 杭州 3100583．） 用荧光探针FDA标记细胞，川楝子23个化学组分快速筛查，发现5个具有明显毒性。Meliasenin B, trichilinin D 及 1-O-tigloy-1-O- debenzoylohchinal）。进一步实验研究发现，这3个成分对 HepG2细胞川楝子毒性发现其中3个化学成分对HepG2细胞有毒性。 ( 仪器与试药 1.1 洁净工作台 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；CO2细胞培养箱（Thermo，美国）；96 孔细胞培养板（Coring，美国）；移液器、八孔道排枪（Eppendorf，德国）；CKX41光学显微镜（Olympus，日本）Anke LXJ-IIB 低速大容量多管离心机（上海科学仪器厂）；细胞荧光显微图像自动分析平台(浙江大学药物信息学研究所开发)；R-200型旋转蒸发仪（Buchi公司，瑞士）；Agilent 1200型制备液相色谱仪美国）；Bchi中压液相色谱系统Buchi公司，瑞士；LCQ Deca XP plus 离子阱质谱检测器 (Finnigan质谱公司，美国)；药物抑制浓度计算软件（LOGIT法，版本1.0.0）。 人肝癌细胞株 (HepG2 ，上海细胞库)；胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶-EDTA、高糖DMEM培养fluorescein diacetate，FDA 方法与结果 2.1 川楝子化学组分的制备 川楝子药材粉碎后依次无水乙醇乙酸乙酯（1:1）70 %乙醇提取，。A01中压柱分离A04、A05和A06。A02中压柱分离A07、A08和A09。A05A08样品C01~C15和B01~B15。 2.2 川楝子肝毒性组分的体外筛查 使用前期所建方法[]对上述从川楝子中制备的23个化学组分进行快速筛查。取对数生长期的HepG2以3000个/孔接种于96孔板的中间60孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h细胞完全贴壁后，弃去每孔中的培养液，每孔用100 μL的PBS漂洗1次并吸干，加入含50 μg?m1待筛查组分溶剂对照0.1%DMSO）和阳性对照163.5 μmol?L-1的盐酸氯丙嗪）的培养液共孵育48 h后，弃去每孔中的培养液，每孔加入100 μL含2.5 μg?m1 FDA的PBS，孵育15 min，每孔用100 μL的PBS漂洗1次，吸干，在荧光显微自动分析平台上获取每孔细胞荧光图像。计算细胞存活率，存活率低于20%时，表明该组分具有明显毒性。 2.3 液质联用分析及结果 色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，线性洗脱梯度：0-50 min，40%-80% B，流速：0.8 mL?min-1；检测器：二极管阵列检测器，波长扫描范围：190 ~ 400 nm；柱温30℃；进样量10 μL。 350 ℃；离子源喷雾电压3.5KV；毛细管电压20 V；载气流速(N2)60 arb，辅助气流速(N2)20 arb；扫描范围m/z 100~1000。A05和C09组分正离子总离子流图见图1。 图1 样品A05和C09总离子流图 Fig1 TIC of the sample A05 and C09 表1 A05和C09组分液质分析和化合物推测结果 Table 1 Chromatographic and mass spectral data of compounds in A05C09 components 峰号 保留时间(min) [M+H]+ 化合物推测 1 11.19 607 1-deacetylnimbolinin A 2 16.08 599 12-O-methylvolkensin 3 24.9 485 meliasenin N 4 38.1 469 *meliasenin B 5 12.42 645 12-O-acetylazedarachin B 6 13.91 599 12-O-methyl-1-O-deacetylnimbolinin B 7 26.13 639 *trichilinin D 8 27.18 575 mesendanin H 9 28.15 567 *1-O-tigloy-1-O-debenzoylohchinal 10 33.29 567 Isomer of 9 *为自制对照品 将meliasenin B、trichilinin D和1-O-tigloy-1-O- debenzoylohchinal分别从100 μ