小叶榕水提物对HBsAg和HBeAg体外抑制作用的实验研究.docVIP

　　小叶榕水提物对HBsAg和HBeAg体外抑制作用的实验研究 作者：刘妮 肖会泉 沈海容 杨丽 【摘要】 目的：观察小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响，探讨小叶榕水提物体外抗HBV作用。方法：通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察小叶榕水提物对2.2.15细胞的影响，采用ELISA法检测分析小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制作用。结果：小叶榕水提物对2.2.15细胞的半数毒性浓度为0.263mg/ml，该浓度对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达87.7%、93.6%， 治疗 指数分别为2.25和2.31。结论：小叶榕水提物有较好的体外抑制HBV作用，具有潜在的抗HBV开发前景。 【关键词】 小叶榕水提物 2.2.15细胞株 抗病毒 HBsAg HBeAg 小叶榕叶为桑科植物榕树Ficus microcarpa L.f.的叶，异名落地金钱(《本草求原》)。全世界榕树有八百多种，主要分布在热带亚热带地区。我国榕属植物约100种，属热带雨林的关键种类，主要分布在福建、广东、广西、海南、浙江和 中国 台湾 等地区，为当地的主要植物品种之一。入药主用其叶Folium Fici Microcarpae。有研究表明[1]，小叶榕叶中主要含黄酮、三萜类、齐墩果酸、脂肪族化合物和甾体化合物等。其中黄酮类和内酯类等有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抗炎、抑菌、抗癌等方面有显著效果，无毒副作用，并以此开发出多种药品和保健食品[2]，但抗病毒作用未见报道。为探索小叶榕水提物治疗病毒性肝炎的疗效和机制，本实验通过观察小叶榕水提物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用，探讨小叶榕水提物可能的体外抗乙型肝炎病毒作用，为进一步研究小叶榕水提物治疗病毒性肝炎和其他病毒性疾病提供实验依据。 　　 1 材料和方法 　　1.1 材 料 ①小叶榕水提物(广州中医药大学热带医学研究所药剂室提供)。药物处理临用时以小叶榕水提物配制成浓度为100mg/ml的原液，用DMSO溶解，实验前用时以含2%血清、380(g/ml G418的DMEM 高糖培养液倍比稀释为： 2.1、1.05、0.53、0.26、0.13、0.07、0.03、0.02mg/ml等8个所需浓度。②2.2.15细胞株(中国人民解放军空军广州总 医院 病毒研究室)。③高糖DMEM 培养液、G418(GIBCO公司);胎牛血清[中国医学 科学 院血液学研究所(天津) (56℃ 、30分钟灭活)];谷氨酰胺、MTT、二甲基亚砜(DMSO)和胰蛋白酶均(Sigma公司);HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂(华美生物工程公司)。青霉素、链霉素(华北制药有限公司);细胞培养瓶(Corning公司);细胞培养板(cosmo公司);-86℃ 超低温冰箱(Reveo);二氧化碳培养箱(Napco);宝特ELx800全自动酶标检测仪(美国);倒置显微镜(Olympus，BX60)。 　　1.2 方 法 　　1.2.1 2.2.15细胞培养 细胞用0.06%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化，用DMEM 高糖培养液培养，培养液临用时添加胎牛血清至终浓度为10%，G418终浓度为380μg/ml，谷氨酰胺终浓度为0.03%，青霉素、链霉素各为100IU/ml，用0.238%Hepes调pH值至6.8。将细胞制成单个悬液后移入培养瓶，置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，每3～4天传代1次。 　　1.2.2 细胞毒性实验 用0.06%胰蛋白酶消化并将2.2.15细胞轻轻吹打分散成单个细胞悬液，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配成细胞浓度为5×104个/ml的细胞悬液，按0.1ml/孔分种于96孔板，置37℃ 、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养，24小时后加用含药培养维持液0.1ml/孔，每个浓度加4孔。以小叶榕水提物原液作系列两倍稀释，配制成含2%胎牛血清的不同浓度的细胞维持液，分别为以下8个浓度(2.1、1.05、0.53、0.26、0.13、0.07、0.03、0.02mg/ml)。然后按0.1ml/孔分种各孔，置于37℃ 、饱和湿度、5%CO2培养箱内继续培养，待药物与细胞作用5天，观察细胞形态及其生长状态后，轻轻吸取培养细胞上清液以备ELISA法测定HBsAg、HBeAg，所余细胞用MTT法测定药物细胞毒性，实验另设含2%血清、380μg/ml G418的DMEM培养液空白对照组和细胞对照组各4孔。测定药物对细胞生长的半数毒性浓度：按Sargent JM等建立MTT法检测[4]。向前述所余细胞加入400μg/ml MTT 0.1 ml/孔，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内孵育