分子生物学（贾海燕）第五章.docxVIP

第五章　DNA的复制DNA半保留复制的提出关于DNA复制机制的学说全保留复制分散复制半保留复制DNA半保留复制的实验验证复制子:生物体内能独立进行复制的单位复制起始点：DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。复制泡：DNA合成时从复制起点开始向一边或两边移动，形成的泡状中间产物。复制叉：复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉复制区域父本区复制区复制方向双向单向：双向等速为主单复制子与多复制子（真核多起点复制子）DNA复制的特点方向为5’→3’冈崎片段与半不连续复制前导链:合成方向与复制叉移动的方向一致，通过连续的5’→3’聚合反应合成的新的DNA链。后随链：与前导链相反冈崎片段：是在DNA半不连续复制中产生的长度为1000-2000 nt的短DNA单链片段，能被连接形成一条完整的DNA链。需要RNA引物：RNA引物在片段连接之前被去掉，产生的间隙由DNA填补。用RNA引导DNA的复制对DNA复制的高忠实性至关重要。需要多种酶和蛋白质参与原核生物DNA复制与解链有关的酶和蛋白Dna B：DNA解旋酶通过水解ATP获得能量，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。单链结合蛋白：SSB(Single-stranded DNA-binding protein)四聚体位于复制叉，循环使用协同效应：原核生物中，如果第一个SSB结合到DNA上的能力为1，则第二个SSB的结合能力可高达1000。（真核生物无协同效应）拓扑异构酶前理解：大多数天然状态下的DNA分子具有适度的负超螺旋有利于蛋白质和DNA的结合。在复制过程中，随着DNA的解旋，盘绕数减少，扭曲数增加，使得正超螺旋增加，未解链部分缠绕更加紧密，形成的压力使解链不能继续进行。拓扑异构酶能够消除解链造成的正超螺旋的堆积，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使得复制得以延伸。酶特点：既能水解磷酸二酯键，又能连接二酯键。酶类型特点是否需要能量Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态（负超螺旋）以水解高能磷酸键放能，不需能量Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛；利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。需能量DNA聚合酶DNA pol Ⅰ：（Kornberg酶）酶活性：3种5’→3’聚合酶5’→3’外切酶(exonuclease,那么内切intronuclease)只能在5’-P末端一个接一个地切除nt；能连续地切除多个nt；既能切除脱氧核苷酸也能切除核苷酸，可用于RNA引物的去除。3’→5’外切酶活性校正功能：保证复制有尽可能高的保真度。Klenow片段：绿色和黄色部分的一部分DNA polⅠDNA pol Ⅰ应用：去除RNA引物、DNA损伤修复以及DNA体外标记DNA体外标记(制备探针时在探针上进行标记)的方法缺口平移法 (Nick translation)末端标记法（ Klenow片段 ）有5’→3’活性和3’→5’外切活性随机引物法（ Klenow片段 ）：引物长度：6-7 ntDNA pol Ⅱ：具有5’→3’方向的聚合酶活性和3’→5’外切酶活性。酶活性很低，只有DNA聚合酶I的5%，可能主要在DNA损伤修复中起作用。DNA pol Ⅲ:a.全酶由7种不同的亚单位组成(α, ε, θ, τ, γ, δ, β)。每个亚单位有其特定的功能。b.它既具有5’→3’ 聚合酶活性，也有3’→ 5’核酸外切酶活性。c. 该酶的活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，DNA聚合酶II的300倍，是大肠杆菌DNA复制中起主导作用的酶。d. 复制时，两个Poly III酶组成二聚体，结合于复制叉上，同时进行前导链和后随链的合成。DNA复制的过程：起始（1）OriC:Dna A ：它的合成与生长速度相偶联，因此复制的起始也与生长相偶联在细胞高速生长期，原核生物的染色体可以在第一轮复制完成之前就从两个新形成的起始点开始第二轮复制。（见右图）Dna A蛋白是一个由30-40个分子构成的复合体，每一个分子结合1个分子ATP，便于3个13 bp长的富含AT的重复序列的解链，从而使Dna B蛋白结合上去。Dna B是一个解链酶，利用ATP水解的能量结合并解开双链DNA。之后SSB蛋白结合以防止断裂和重新复性（2）引物合成DNA合成是从DNA引发酶合成的一段RNA引物开始，再由DNA聚合酶从引物3’端开始合成新链。前导链合成前， DNA引发酶在起点合成RNA短链，经RNase H去除短链中不必要部分。这些短链把起点处DNA双链分开以便引发体与特定序列结合，进而合成RNA引物。引发酶: 依赖于DNA的RNA聚合酶，其功能是在DNA复制过程中合成RNA引物。引发体 (Prim