分子生物学实验操作方法与技巧3.pptVIP

标准的限制酶酶切体系 一般是1μg底物DNA，在50 μl终反应体系中，用1个单位（1 Unit）的内切酶催化，在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时。 酶解1μg以下或以上的DNA，可按上述标准体系进行缩小或放大。加入过量的内切酶，可以缩短反应时间并达到酶切完全的效果，但是不能过分加大酶的用量，以免产生星活性。所以我们推荐稍过量的酶（2-5倍）较长的反应时间。 对于绝大多数酶切反应，通常4-6小时都足以完全酶切反应底物。如果底物不纯或难以酶切，通常过夜酶切（8-12小时）可实现底物的完全酶切。但不推荐太长的酶切时间（18小时以上），太长的酶切时间（或许还有酶量过多的原因）有时会把反应底物切成碎片。 由于某些未知的原因，有时按预实验结果放大酶切体积的时候，会导致酶切效果不理想。如果重复一次实验仍然不能解决问题，这种情况下最好的办法是做多管小体积的酶切实验，最后把酶切产物汇集到一起进行电泳、回收酶切片段。 星活性（Star activity） 限制酶根据反应条件的不同，可能会切断与原来认识序列不同的位点，这种不同于原来的特异性的活性，称为星活性。一般产生星活性的主要原因是反应体系中酶量太多（一般不要超过15－20％），或样品中甘油含量多（一般不要超过10％），或酶切温度变化（如从37?C变为30 ?C ）。 双酶切反应 使用两种酶同时进行DNA切断反应，是实验操作中非常常用的手段。此