3结语-食品与生物技术学报.doc

文章编号:1673-1689(2015) - - ?? 筛选特异性抑制酿酒酵母产孢的人类基因( ?殷政，中西秀树，李子杰，张慧杰，藤田盛久，高晓冬 （江南大学 生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122） ? 摘　要：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)二倍体细胞 关键词：酿酒酵母;筛选;人类基因;抑制产孢;减数分裂 中图分类号：Q781 酵母与哺乳动物细胞同为真核生物,二者具有很多相似的结构,将酵母作为研究人类基因的工具具有巨大的优势，其遗传背景清晰，培养简单，基因操作技术成熟完备，极大降低了哺乳动物细胞各种复杂的生理过程对蛋白研究的干扰。1987年Lee和Nurse[1]在裂殖酵母中表达了人类cDNA筛选得到能回补裂殖酵母cdc2[2]将SSO1的SNARE区域替换人源syntaxin1A通过突变分析得到产孢的突变体发现218位谷氨酸残基为S1产孢功能所必须为筛选与syntaxin1A作用的蛋白或药物提供了更为简便的方法同时人类的某些基因确实可以参与产孢过程中的某些环节并对其产生影响 酿酒酵母二倍体细胞[3]，进入减数分裂过程并产生四个单倍体细胞核[4, 5]。随后细胞质膜通过高尔基体post-Golgi secretory vesicles)重新定位在纺锤体极体(spindle pole bodies)，形成前孢子膜(prospore membrane)且不断延伸，最后前孢子膜闭合形成未成熟的孢子[6-8]。接着在前孢子膜的表面进行孢子壁的组装，孢子壁组装完成标志着成熟孢子的形成。孢子壁具有四层结构，从里到外分别是甘露糖层，β-葡聚糖层[9]，壳聚糖层和二酪氨酸层[10]，其中二酪氨酸层作为孢子形成过程的最后一环，同时赋予孢子抵御外界环境压力的能力[11-13]。由于二酪氨酸层的存在，孢子在10%的氨水缓冲液下使用UV照射具有自荧光特性[12]。 酿酒酵母的产孢过程虽然并不存在于哺乳动物细胞中但[14]，尤其是基本细胞代谢及分裂有关的基因存在着高度的基因保守性[15-17]。人体中重要的蛋白质很多都是在酵母中先被发现其同源物，其中包括有关细胞周期的蛋白、信号蛋白和蛋白质加工酶等[18]。 本研究建立了一个筛选特异性抑制酿酒酵母产孢过程的人类基因的方法，使用实验室构建的带有人类基因的酵母表达质粒pRS426-TEFpr-geneX，在二倍体酿酒酵母中表达单独的人类基因。利用二酪氨酸层具有自荧光特性，通过实验证明孢子的相对荧光可以功能和调节机制尚未完全清楚 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌株和质粒 酿酒酵母AN120野生型菌株，dit1Δ缺陷型菌株，AN117-4B野生型菌株，大肠杆菌T1噬菌体抗性菌株，大肠杆菌DH5α以及质粒相关信息见表1。 表1本研究使用的菌株与质粒 Table 1 Strains and plasmids used in this study 菌株/质粒 基因型/说明 来源 AN120(野生型，二倍体) MATα /MATa ARG4 /arg4-NspI his3ΔSK /his3ΔSK ho: : LYS2 /ho: : LYS2 leu2 /leu2 lys2 /lys2 RME1 /rme1: : LEU2 trp1: : hisG /trp1: : hisGura3 /ura3 [4] HW3( dit1Δ 缺陷型) AN120 dit1Δ: : his5 + /dit1Δ: :his5 + [19] AN117–4B( MATα ura3 leu2 trp1 his3$sk arg4-NspI lys2 ho::LYS2 rme1::LEU2 实验室保藏 T1-Phage Resistant E. coli F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ?M15 ?lacΧ74 recA1 araD139 ?(ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG λ-tonA 购于Life公司 DH5α F– Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK–, mK+) phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1 实验室保藏 pENT221 entry vector 购于Life公司 pRS426-TEFpr 实验室保藏 pRS426-TEFpr destination vector Ampr, URA3标记,多拷贝,含有TEF启动子,含有attL1/2交换位点 本研究构建 pRS426-TEFpr-geneX Ampr, URA3标记,多拷贝,含