DNA提取原理及方法.ppt

实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失 尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 DNA提取常见问题 问题三：DNA提取量少。 对 策 原因 猕猴桃DNA提取实例 1.CTAB配方如上,配制好备用,65度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化 2.65°水浴一个小时 3.氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分离心20分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干5分钟挥发掉乙醇后加入3-5mlTE溶解，加入5ul,1mg/ml的RNA酶后保存 猕猴桃基因组DNA DNA提取方法简介 DNA提取的几种方法 　基因组DNA的提取 　CTAB法 　SDS法 　其它 DNA提取的几种方法 　非基因组DNA的提取 　质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法　 　线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 　CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 基因组DNA－ CTAB法 　CTAB提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB PVP40 β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（V/V）使用前加入 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 基因组DNA－ CTAB法 PVP（聚乙烯吡咯烷酮） PVP 按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。 在研磨过程中加入PVP，其中的CO-N=基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。 同时向抽提液中加入还原剂β-巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。 　CTAB法流程图 植物材料 裂解液 上层溶液 液氮研磨 抽提 细胞裂解 干燥溶解 离心洗涤 酒精沉淀 DNA溶液 基因组DNA－ CTAB法 SDS法原理 基因组DNA－SDS法 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 　组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH 8.0 ） 　NaCl SDS 　终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2% SDS法DNA提取缓冲液 2.65 水浴 60min, 其间缓慢摇动几次。 3