鼻咽癌细胞中miR-9表达下调的甲基化机制研究.PDFVIP

第10卷第5 期 Vol.10 No.5 2017 年3 月 March 2017 鼻咽癌细胞中 miR-9 表达下调的甲基化机制研究 1 1 2 3 1 1 罗花南 ，马思敬 ，易春曦 ，曹 辉 ，郭海丽 ，侯 瑾 ， 闫 静1 ，任晓勇1* （1. 西安交通大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科病院，西安 710004 ； 2. 西安市中心医院耳鼻咽喉头颈外科，西安 710004 ； 3. 西安医学院第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科，西安 710077 ） 摘要：目的：研究miR-9 在鼻咽癌细胞中表达下调是否与相应的编码基因启动子区 DNA 甲基化相关，明确 miR-9 表达失调的分子机制。方法：实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR ，qRT-PCR ）检测分析正常 鼻咽上皮细胞NP69 和鼻咽癌细胞C666-1 中加入去甲基化药物5-杂氮-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine ，5-AZA ） （50 μmol/L ，连续作用72 h ）（NP69/C666-1 5-AZA 组）和去乙酰化酶抑制剂曲古柳菌素A （trichostatin A ，TSA ） （10 nmol/L，继续作用24 h ）（NP69/C666-1 5-AZA+TSA 组）后细胞中miR-9 的表达变化。同时，利用CpG Island Searcher 软件对hsa-miR-9 的编码基因hsa-miR-9-1 、hsa-miR-9-2 和hsa-miR-9-3 启动子区的CpG 岛进行 分析，应用重亚硫酸盐测序（bisulfite genomic sequencing ，BGS ）检测5-AZA 和TSA 对hsa-miR-9-1 、hsa-miR-9-2 、 hsa-miR-9-3 启动子区 CpG 岛甲基化程度的影响。最后，应用CCK-8 细胞增殖实验、流式细胞术、Transwell 侵袭实验分析5-AZA 和TSA 对C666-1 细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。结果：与NP69 对照组相比，NP69 5-AZA 组和NP69 5-AZA+TSA 组miR-9 的表达水平和hsa-miR-9-1 、hsa-miR-9-2 、hsa-miR-9-3 的甲基化率均 无显著变化（P 0.05 ）。与C666-1 对照组相比，C666-1 5-AZA 组、C666-1 5-AZA+TSA 组miR-9 的表达水平 分别上调 11.31 倍和22.63 倍，差异有统计学意义（F=780.280 ，P=0.000 ）。BGS 结果显示，C666-1 对照组、 C666-1 5-AZA 组和C666-1 5-AZA+TSA 组hsa-miR-9-1 的甲基化率分别为78.8% （67/85 ）、32.9% （28/85 ）和 14.1% （12/85 ），hsa-miR-9-2 的甲基化率分别为72.2% （39/54 ）、38.9% （21/54 ）和14.8% （8/54 ），hsa-miR-9-3 的甲基化率分别为76.0% （133/175 ）、32.0% （56/175 ）和20.6% （36/175 ），差异均有统计学意义（χ2=77.324 ， 2 2 P=0.000 ；χ =36.850 ，P=0.000 ；χ =122.407 ，P=0.000 ）。5-AZA 和TSA 处理后，C666-1 细胞的增殖和侵袭能 力均显著下降（P