硫辛酸在神经细胞老化过程中的细胞保护作用研究.docVIP

　　硫辛酸在神经细胞老化过程中的细胞保护作用研究 作者：张毅 苗玲 苏敏 蔡琰 【摘要】 目的 探讨硫辛酸在神经细胞老化过程中抗氧化损伤和对细胞的保护作用。方法 应用实验性神经细胞老化模型，设立不同浓度的硫辛酸作用组和不含硫辛酸的对照组，分别在培养至5、10、15 d用MTT法分析神经细胞的存活率，并检测细胞内脂质过氧化反应物丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果 硫辛酸浓度自25～300 μmol/L内能显著提高老化各阶段的细胞生存率，与对照组比较，差异显著；其中以100 μmol/L的效果最大。与对照组相比，100 μmol/L硫辛酸作用组能显著降低细胞内MDA含量(P＜0.05)；提高SOD活力，但差异不显著。结论 在体外培养的神经细胞老化模型中，硫辛酸能显著降低细胞内脂质过氧化反应，提高细胞抗氧化能力，提高细胞的生存率，延缓老化的进程。 【关键词】 神经细胞老化；硫辛酸；存活率；MDA； SOD 硫辛酸是一种几乎存在于所有原核和真核细胞中的天然抗氧化剂，具备一般抗氧化剂所不能及的抗氧化性，其用于糖尿病周围神经病变有很好的 治疗 价值。随着对氧化应激研究的不断深入，硫辛酸的抗氧化特性以及作为神经保护剂的潜能越来越吸引人们的关注。本研究采用本实验室建立的神经细胞老化实验研究模型——无血清培养神经母细胞瘤细胞，通过对不同老化时期细胞存活数的分析，以及对细胞内脂质过氧化的主要产物——丙二醛(MDA)含量和自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)活力的检测，分析硫辛酸抗氧化延缓神经细胞老化的作用效果。探讨硫辛酸在神经细胞老化进程中对神经细胞的保护作用。 1 材料与方法 1.1 材料 硫辛酸(纯品原料)：上海 现代 制药有限公司赠送。细胞株：神经母细胞瘤细胞A2(NBA2)，由美国新墨西哥洲洲立大学Davise教授馈赠。主要试剂：高糖DMEM，0.25%胰蛋白酶(含EDTA)，购自美国Invitrogen公司；牛血清白蛋白、胰岛素，购自Sigma公司；MTT 和小牛血清购自上海华美生物公司；MDA、SOD和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司。 1.2 方法 ①培养液配制： DMEM培养液：DMEM粉剂按要求溶解于800 ml双蒸水中，并添加碳酸氢钠3.7 g，庆大霉素5万U，调整pH至7.2，然后加双蒸水至1 000 ml，经0.2 μm滤膜正压过滤灭菌。含10%小牛血清的DMEM(BD)：按DMEM∶小牛血清=9∶1配制。无血清培养液(AI)：DMEM粉剂按要求溶解于800 ml双蒸水中，另添加碳酸氢钠3.7 g，庆大霉素5万U，牛血清白蛋白500 mg，胰岛素5 mg，调整pH至7.2，最后加双蒸水至1 000 ml，。配制的AI培养液经0.2 μm滤膜正压过滤灭菌。含硫辛酸的AI培养液(LA)：在AI中加入相应浓度的硫辛酸。②NBA2细胞培养及神经细胞老化模型建立：液氮保存的NBA2细胞株快速解冻复苏后接种于含BD的培养瓶中，培养瓶置于37℃，5%CO2培养箱(TABAI)中培养，第2天换培养液，然后每3 d换液1次，细胞生长面积达到瓶底面积80%以上，进行传代培养。建模时，BD制备细胞悬液后，按一定密度接种，2 h后换成AI培养液，在37℃，含5%CO2的空气中培养，每3 d更换培养液，按不同的培养天数分组，设立5、10和15 d组。③硫辛酸对细胞老化过程中存活数的影响：采用神经细胞老化模型，实验随机分成对照组(AI组)和含硫辛酸的实验组(LA组)，LA组在AI培养液中所添加的硫辛酸浓度依次为10、25、50、75、100、150、200、250、300 μmol/L等，并按不同浓度分组。LA组与AI组均设立培养5、10、15 d组。细胞用BD制备悬液后，以1.0×104个/孔的密度接种于96孔培养板内，每组重复8孔，每孔添加培养液100 μl，2 h后换成AI及含各相应浓度LA的培养液。每3 d更换培养液1次。各时间组以相隔5 d周期接种细胞，分别于培养至5、10、15 d时同时终止培养，加入MTT染色，检测活细胞的数量。④MTT法检测神经细胞存活数：在96孔板的各孔中加入新鲜配制的5 mg/ml的MTT溶液20 μl，在37℃，5%CO2培养箱中孵育4 h，然后去除溶液，每孔中加入150 μl DMSO(AMRESCO产品)，震荡10 min溶解结晶，最后用酶标仪(BioRad 680)在570 nm波长下测定各孔的吸光度，吸光度的大小反映了存活的细胞数量。以5 d对照组为标准，细胞存活率定为100%，其他各组吸光度与之相比，得到细胞相对存活率。⑤硫辛酸对细胞老化过程中MDA含量和SOD活力影响：应用神经细胞老化模型，实验分成AI组和LA组，LA组的硫辛酸浓度