仪器分析电泳技术[毕业论文].pptVIP

电泳技术 一、基本原理 二、电泳类型 三、操作规程 一、基本原理 二、电泳类型 二、电泳类型 （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、概述 聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺在催化剂的作用下聚合交联成含有酰胺基侧链的脂肪族大分子化合物。 在聚丙烯酰胺凝胶电泳中SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质及小分子核酸进行量化、比较和特性鉴定的一种快速方法。在蛋白质样品中加入SDS后，所有的蛋白质分子都与SDS结合并带有负电荷，因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小，而于蛋白质本身的等电点无关。 （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。 2、试剂 丙稀酰胺溶液中含有甲叉双丙稀酰胺 过硫酸铵（聚合的引发剂） 四甲基乙二胺是加速剂，可加快聚合的速度 3、仪器 垂直板电泳槽和电泳仪 4、操作步骤 1） 倒制胶板 首先选择凝胶的浓度，高浓度凝胶的 孔径较小 对于小分子量的蛋白质有较高的分辨率，相反低浓度的凝胶 对于大分子量的蛋白质有较高的分辨率。将两玻璃板密封 好，将所需浓度的分离胶溶液按比例加入烧杯混匀。倒入密 封好的玻璃板间隙中（如果采用倒胶槽，可将胶液直接倒入 倒胶槽）用少量正丁醇覆盖液面，以隔绝空气，并产生整齐 的上液面（注意：由于丙稀酰胺是神经毒，在制胶过程中需 要戴手套，凝胶聚合后则不再有毒性），胶液的聚合大约需 要半小时，随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶 溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。 2）加样与电泳 蛋白质样品在加样前需要和样品 缓 冲液混合并煮沸5min，使蛋白质发生溶解、变 性。样品缓冲液中的甘油使样品溶液的密度变 大，避免加样后样品上漂；2-巯基乙醇使蛋白质 中的二硫键断裂，并不再形成新的二硫键，溴 酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。将制 胶板中的密封教条除去，装入电泳槽，在正负 极水槽中加入电极缓冲液，将预处理后的蛋白 质样品加入对应的梳空，装好电泳槽，接好电 源，开始电泳。施加在每块胶板上的电流强度 应该在30mA左右。 3）染色与脱色 电泳结束后，分离玻璃板，取出 凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考 马氏亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中 脱色。脱色过程中需要更换3～4次脱色液 （如果在脱色液中加入海绵和泡沫碎片以吸附 染液中的考马氏亮蓝，可加快脱色速度并且 可不必更换脱色液）。经染色、脱色后可得 到条带清晰的凝胶，在有图象记录和分析的 条件下，可用凝胶成像系统对凝胶进行数字化 成像、储存及定量分析。 5、结果与讨论 1）制胶与实验结果重复性的关系：由于每次制胶时这种试剂量的加入量有误差，采用一次配制多块胶板的方法可大大提高实验的重复性。 2）样品分子量与凝胶浓度的关系：目标蛋白质的分子量较大时，应采用浓度较低的凝胶，以获得较高的分辨率；反之，对分子量较小的蛋白质，应采用浓度较高的凝胶。 3）凝胶聚合时间长短与凝胶质量的关系：凝胶的聚合应该在30～60min内完成，聚合太快凝胶不均匀，太慢则浪费时间。聚合的快慢可以增减TEMED（四甲基乙二胺）的加入量来改变。 4）电泳的快慢与电流之间强弱的关系：电流强时电泳速度加快，但产热较多影响奋力效果；电流过低时产热虽少，但对蛋白质游离不利。常用的电流强度应该是每块胶板30mA左右。 （二）琼脂糖凝胶电泳 1、概述 聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋白质分子大得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。 （二）琼脂糖凝胶电泳 2、试剂和仪器 水平电泳槽、电泳仪 溴化乙锭是荧光染料与核酸结合后在紫外线照射下可产生橙红色荧光，由于溴化乙 锭有潜在的致癌性，操作时需要戴手套。 3、操作方法 （1）含有琼脂糖的缓冲液经微波炉加热后被溶解，倒入制胶系统中，插入梳子，琼脂糖凝固后，拔掉梳子，将塑料托盘放入电泳槽，加入缓冲液，经加样后即可接通电源进行电泳。 (2)BIO-RAD 水平电泳仪操作规程 1）打开电源 插上电泳仪电源，打开右侧面后部开关。主面板指