重组蛋白制备精要.ppt

等点聚焦层析： 基于蛋白质等电点不同的分离。以阴离子交换剂为固定相为例，两性电解质缓冲液和离子交换基团相互作用形成pH梯度，蛋白质在pH 大于其等电点时吸附，在pH低于其等电点时解吸附。由于蛋白质区带后部所处微环境的pH总是低于其前部所处微环境的pH，后部区带的蛋白质先于前部开始移动，产生聚焦效应。可分离等电点仅差0.02的蛋白质。 层析方法 亲和层析 凝胶过滤层析 离子交换层析 疏水层析 分离机制 特异性亲和 大小 电荷 疏水性 选择性 非常高 中等 高 高→中等 载量 高 低 高 高 纯化速度 中等 中等→低 高 高 生物相容性 好 非常好 好 中等→好 目标蛋白得率 高 低 中等 中等 捕获浓缩阶段 +++ + ++ ++ 中间纯化阶段 +++ + +++ +++ 精制纯化阶段 ++ +++ +++ + 酶在纯化过程中的一些技术难点： （一）杂质的除去 酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、多糖、脂类和核酸等 。 （1）pH和加热沉淀法 （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋白。 （3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可用2.5%三氯乙酸处理。 （4）核酸沉淀剂法 用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便于离心分离。用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。 （5）将酶与底物结合 酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，热稳定性大大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。 （二）脱盐和浓缩 1、脱盐 脱盐方法是透析和凝胶过滤。 2、浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。 （三）酶的结晶 把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达50%以上），可使其结晶，酶的纯度经常有一定程度的提高。为研究蛋白质空间结构提供X射线衍射样品。 （四）酶分离和纯化工作的注意事项 1、防止酶蛋白变性 2、防止辅因子的流失 3、防止酶被蛋白水解酶降解 阿拉伯糖表达系统： 大肠杆菌RNA聚合酶负责转录pBAD启动子控制的外源基因转录。属于严紧型表达系统，目标蛋白mRNA分子的转录过程可以通过诱导物的调控来达到严格的开放/关闭状态，诱导物L-阿拉伯糖(L-arabinose)浓度连续变化实现外源重组蛋白表达水平的连续调控。无诱导物时，pBAD启动子控制的外源基因的转录受araC蛋白抑制。 色氨酸－lacI表达系统（Trp-lac）： 大肠杆菌RNA聚合酶转录Ptrp启动子控制的外源基因转录。诱导物为IPTG，无诱导物时，外源基因的转录受lacI蛋白抑制。 真核表达系统 酵母表达系统 啤酒酵母，可表达在啤酒酵母细胞内的表达载体上编码的重组蛋白；甲醇酵母，表达的重组蛋白的编码基因与各种必需的表达元件已整合到甲醇酵母基因组中。 昆虫表达系统 具有昆虫特异性的启动子，外源基因处于启动子下游。 哺乳细胞表达系统 哺乳细胞病毒特异性启动子，外源基因处于该启动子下游，调控外源基因转录过程。 生物加工厂 转基因动物，基因组中整合了目标蛋白的编码基因与表达元件，转寄因鸡、猪、牛、羊等 无细胞翻译系统 大肠杆菌无细胞翻译系统 即大肠杆菌细胞裂解液。大肠杆菌细胞有一定要求，一般是核酸酶与蛋白酶缺失突变株，核酸酶缺失大大降低了mRNA的降解，而蛋白酶的缺失降低了合成的目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白产量。一般用于表达原核生物蛋白。 兔网织红细胞无细胞翻译系统 一般用于合成真核生物蛋白，可以保证有效的进行蛋白翻译后的各种修饰。 蛋白纯化 重组蛋白纯化标签 6XHis：6个连续组氨酸 GST：谷光甘肽转移酶 Chtin Binding Domain：几丁质结合结构域 Maltose Binding Protein：麦芽糖结合蛋白 Biotinated peptide：生物素化多肽链 Step Tag II：短肽序列，生物素功能类似物 FLAG（DYKDDDDK）：短肽序列， S tag：短肽序列，结合S tag 抗体 T7 tag：短肽序列，结合T7 tag 抗体 选择亲和标签时需考虑的因素 亲和标签是否会影响目标蛋白的结构和功能（小） 蛋白质的稳定性 亲和标签所融合的位置（N端，C端） 是否需在变性条件下进行亲和纯化（标签适合否） 亲和标签对表达水平的影响（标签、蛋白、系统） 是否需标签具有鉴定功能 亲和洗脱的条件（不使蛋白变性） 亲和介质和缓冲液的费用 是否在亲和纯化后去除标签 His标签和金属螯合亲和层析 金属螯合层析原理：基于蛋白质表面的一些特定的氨基